Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا يسمح بإجراء تقييم غير جراحي وآلي للأداء الحركي الدقيق ، بالإضافة إلى التعلم الحركي التكيفي والترابطي عند التحديات ، باستخدام جهاز يسمى سلم إيراسموس. يمكن معايرة صعوبة المهمة للكشف عن ضعف الحركة الذي يتراوح من درجات كبيرة إلى درجات دقيقة.
Abstract
يتشكل السلوك من خلال الإجراءات ، وتتطلب الإجراءات مهارات حركية مثل القوة والتنسيق والتعلم. لن يكون أي من السلوكيات الأساسية للحفاظ على الحياة ممكنا دون القدرة على الانتقال من موقف إلى آخر. لسوء الحظ ، يمكن أن تتعرض المهارات الحركية للخطر في مجموعة واسعة من الأمراض. لذلك ، فإن التحقيق في آليات الوظائف الحركية على المستويات الخلوية والجزيئية والدوائر ، وكذلك فهم أعراض وأسباب وتطور الاضطرابات الحركية ، أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة. كثيرا ما تستخدم نماذج الماوس لهذا الغرض.
توضح هذه المقالة بروتوكولا يسمح بمراقبة الجوانب المختلفة للأداء الحركي والتعلم في الفئران باستخدام أداة آلية تسمى سلم إيراسموس. يتضمن الفحص مرحلتين: مرحلة أولية حيث يتم تدريب الفئران على التنقل في سلم أفقي مبني من درجات غير منتظمة ("التعلم الحركي الدقيق") ، ومرحلة ثانية حيث يتم تقديم عقبة في مسار المتحرك. يمكن أن يكون الاضطراب غير متوقع ("تحدي التعلم الحركي") أو يسبقه نغمة سمعية ("التعلم الحركي الترابطي"). المهمة سهلة التنفيذ ومدعومة بالكامل بواسطة البرامج الآلية.
يوضح هذا التقرير كيف أن القراءات المختلفة من الاختبار ، عند تحليلها بأساليب إحصائية حساسة ، تسمح بالمراقبة الدقيقة للمهارات الحركية للفأر باستخدام مجموعة صغيرة من الفئران. نقترح أن تكون الطريقة حساسة للغاية لتقييم التكيفات الحركية المدفوعة بالتعديلات البيئية بالإضافة إلى العجز الحركي الدقيق في المراحل المبكرة في الفئران الطافرة ذات الوظائف الحركية المعرضة للخطر.
Introduction
تم تطوير مجموعة متنوعة من الاختبارات لتقييم الأنماط الظاهرية الحركية في الفئران. يعطي كل اختبار معلومات عن جانب معين من السلوك الحركي1. على سبيل المثال ، يبلغ اختبار المجال المفتوح عن الحركة العامة وحالة القلق ؛ اختبارات شعاع الروتارود والمشي على التنسيق والتوازن ؛ تحليل البصمة يدور حول المشي. جهاز المشي أو عجلة الجري في ممارسة الرياضة البدنية القسرية أو الطوعية ؛ والعجلة المعقدة تدور حول تعلم المهارات الحركية. لتحليل الأنماط الظاهرية الحركية للفأر ، يجب على الباحثين إجراء هذه الاختبارات بالتتابع ، الأمر الذي يتطلب الكثير من الوقت والجهد وغالبا ما يكون هناك العديد من مجموعات. إذا كانت هناك معلومات على المستوى الخلوي أو الدوائر ، يختار الباحث عادة اختبارا يراقب جانبا ذا صلة ويتبع من هناك. ومع ذلك ، لا توجد نماذج تميز الجوانب المختلفة للسلوك الحركي بطريقة آلية.
توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخدام Erasmus Ladder 2,3 ، وهو نظام يسمح بتقييم شامل لمجموعة متنوعة من ميزات التعلم الحركي في الفئران. تتمثل المزايا الرئيسية في قابلية استنساخ وحساسية الطريقة ، إلى جانب القدرة على معايرة صعوبة المحرك وفصل العجز في الأداء الحركي عن ضعف التعلم الحركي الترابطي. يتكون المكون الرئيسي من سلم أفقي مع درجات عالية (H) ومنخفضة (L) بديلة مزودة بأجهزة استشعار حساسة للمس تكتشف موضع الماوس على السلم. يتكون السلم من 2 × 37 درجة (L ، 6 مم ؛ H ، 12 مم) متباعدة 15 مم عن بعضها البعض وموضوعة في نمط متناوب من اليسار إلى اليمين مع فجوات 30 مم (الشكل 1 أ). يمكن تحريك الدرجات بشكل فردي لتوليد مستويات مختلفة من الصعوبة ، أي إنشاء عقبة (رفع الدرجات العالية بمقدار 18 مم). إلى جانب نظام التسجيل الآلي وربط تعديلات نمط الدرجة بالمحفزات الحسية ، يختبر سلم إيراسموس التعلم الحركي الدقيق وتكييف الأداء الحركي استجابة للتحديات البيئية (ظهور درجة أعلى لمحاكاة عقبة ، حافز غير مشروط [الولايات المتحدة]) أو الارتباط بالمحفزات الحسية (نغمة ، حافز مشروط [CS]). يتضمن الاختبار مرحلتين متميزتين ، كل منهما يقيم التحسن في الأداء الحركي على مدار 4 أيام ، تخضع خلالها الفئران لجلسة من 42 تجربة متتالية يوميا. في المرحلة الأولية ، يتم تدريب الفئران على التنقل في السلم لتقييم التعلم الحركي "الجيد" أو "الماهر". تتكون المرحلة الثانية من تجارب معذبة حيث يتم تقديم عقبة في شكل درجة أعلى في مسار المتحرك. يمكن أن يكون الاضطراب غير متوقع لتقييم التعلم الحركي "المتحد" (التجارب الأمريكية فقط) أو يتم الإعلان عنه بنبرة سمعية لتقييم التعلم الحركي "الترابطي" (التجارب المزدوجة).
تم تطوير سلم إيراسموس مؤخرا نسبيا 2,3. لم يتم استخدامه على نطاق واسع لأن إعداد البروتوكول وتحسينه يتطلب جهدا مركزا وقد تم تصميمه خصيصا لتقييم التعلم الترابطي المعتمد على المخيخ دون استكشاف قدرته بالتفصيل على الكشف عن أوجه القصور الحركية الأخرى. حتى الآن ، تم التحقق من صحته لقدرته على الكشف عن الإعاقات الحركية الدقيقة المرتبطة بخلل المخيخ في الفئران3،4،5،6،7،8. على سبيل المثال ، تظهر فئران الضربة القاضية connexin36 (Cx36) ، حيث تضعف تقاطعات الفجوة في الخلايا العصبية الزيتونية ، عجزا في إطلاق النار بسبب نقص الاقتران الكهربائي ولكن كان من الصعب تحديد النمط الظاهري الحركي. اقترح الاختبار باستخدام سلم إيراسموس أن دور الخلايا العصبية قليلة القسيم في مهمة التعلم الحركي المخيخي هو تشفير الترميز الزمني الدقيق للمنبهات وتسهيل الاستجابات المعتمدة على التعلم للأحداث غير المتوقعة 3,4. يظهر فأر الضربة القاضية Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1) ، وهو نموذج لمتلازمة X الهشة (FXS) ، ضعفا إدراكيا معروفا إلى جانب عيوب أكثر اعتدالا في تكوين الذاكرة الإجرائية. لم تظهر خروج المغلوب Fmr1 أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في أوقات الخطوات أو العثرات لكل تجربة أو تحسن الأداء الحركي خلال الجلسات في سلم إيراسموس ولكنها فشلت في ضبط نمط المشي الخاص بها على العقبة التي تظهر فجأة مقارنة بزملائها من النوع البري (WT) ، مما يؤكد عجزا محددا في الذاكرة الإجرائية والترابطية 3,5. علاوة على ذلك ، أظهرت الخطوط الطافرة للفأر الخاصة بالخلية مع عيوب في وظيفة المخيخ ، بما في ذلك ضعف إنتاج خلية Purkinje ، والتقوية ، ومخرجات الخلايا العصبية الجزيئية أو الخلايا الحبيبية ، مشاكل في التنسيق الحركي مع تغير اكتساب أنماط الخطوات الفعالة وفي عدد الخطوات المتخذة لعبور السلم6. تسبب إصابات الدماغ الوليدية عجزا في التعلم المخيخي واختلال وظيفي في خلايا Purkinje يمكن اكتشافه أيضا باستخدام Erasmus Ladder 7,8.
في هذا الفيديو ، نقدم دليلا شاملا خطوة بخطوة ، والذي يوضح بالتفصيل إعداد غرفة السلوك وبروتوكول الاختبار السلوكي وتحليل البيانات اللاحق. تم تصميم هذا التقرير ليكون متاحا وسهل الاستخدام ومصمما خصيصا لمساعدة الوافدين الجدد. يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة للمراحل المختلفة للتدريب الحركي والأنماط الحركية المتوقعة التي تتبناها الفئران. أخيرا ، تقترح المقالة سير عمل منهجي لتحليل البيانات باستخدام نهج الانحدار غير الخطي القوي ، مع استكمال التوصيات والاقتراحات القيمة لتكييف البروتوكول وتطبيقه في سياقات بحثية أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في الدراسة الحالية ، تم استخدام الفئران البالغة (2-3 أشهر) C57BL / 6J من كلا الجنسين. تم إيواء من اثنين إلى خمسة لكل قفص مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء في وحدة حيوانية تحت الملاحظة والحفاظ عليها في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها في دورة مظلمة / إضاءة مدتها 12 ساعة. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للوائح الأوروبية والإسبانية (2010/63/UE; RD 53/2013) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لجنرال فالنسيا ولجنة رعاية بجامعة ميغيل هيرنانديز.
1. إعداد الغرفة السلوكية
- حجز غرفة الاختبارات السلوكية كل يوم في نفس الوقت ووضع قائمة وترتيب الفئران التي سيتم استخدامها ، وكذلك ترتيبات استضافتها.
- احتفظ بفئران التجارب خارج غرفة الاختبار حتى لا تسمع أصوات ضاغط الهواء ونغمات Erasmus Ladder عند عدم اختبارها.
- تأكد من أن جميع مكونات نظام Erasmus Ladder مرتبة وجاهزة للاستخدام: جهاز توجيه الشبكة ، والكمبيوتر المزود بالبرنامج (انظر جدول المواد) ، وضاغط الهواء ، وصندوقي هدف ، والسلم مع وضع الدرجات بشكل صحيح.
- نظف صناديق الأهداف والسلم والدرجات على نطاق واسع بالماء بعد كل وبالماء و 70٪ من الإيثانول في نهاية كل يوم تدريبي.
2. بروتوكول الاختبار السلوكي
- قم بإنشاء تجربة وأدخل البروتوكول في البرنامج (الشكل التكميلي S1).
- قم بتشغيل البرنامج.
- لإنشاء تجربة، اختر ملف | تجربة جديدة | جديد أو إعداد | بروتوكول التجربة.
ملاحظة: البروتوكول الافتراضي ، المستخدم في هذه الدراسة ، يسمى EMC وقد تم تصميمه في المركز الطبي بجامعة إيراسموس ، روتردام. - أدخل اسما للتجربة وانقر على موافق.
- تحقق من أن بروتوكول EMC الافتراضي المحدد يتكون من 4 أيام من الجلسات غير المضطربة (42 تجربة غير مضطربة يوميا) و 4 أيام من جلسات التحدي (42 تجربة مختلطة يوميا: بدون إزعاج ، CS فقط (نغمة) ، الولايات المتحدة فقط (عقبة) ، مقترنة (عقبة معلنة بالنغمة) (انظر الشكل 1B). في اللوحة اليمنى ، تحقق أيضا من إشارة الضوء (3 ثوان كحد أقصى) ، وإشارة الهواء (45 ثانية كحد أقصى) ، والرياح الخلفية (نعم في جميع أنواع التجارب) ، المستخدمة لتشجيع الماوس على عبور السلم ، والنغمة (250 مللي ثانية ، نعم فقط في CS فقط والتجارب المقترنة).
- لإنشاء بروتوكول مختلف، اختر إعداد | بروتوكول التجربة | جديد | من البداية أو النسخ من بروتوكول EMC وتعديله ببساطة ، وتحرير خطوط الجدول المتعلقة بعدد الجلسات (أيام التجربة) وعدد ونوع التجارب في اليوم.
ملاحظة: يمكن أيضا تكييف وقت الراحة ونوع الإشارات والتنشيط والمدة والشدة والفاصل الزمني وفقا للأسئلة التجريبية. - لفتح قائمة جلسات العمل وتسمية الموضوعات، اختر إعداد | قائمة الجلسات.
- انقر فوق إضافة مواضيع ومتغيرات.
- أدخل كل معرف فأر محدد وتاريخ الميلاد والجنس والنمط الجيني والفئات ذات الصلة ، باتباع القائمة المرتبة للفئران.
- ابدأ الجلسة (الشكل التكميلي S2).
- قبل البدء ، تحقق من أن البرنامج مفتوح ، ثم قم بتشغيل السلم.
- تأكد من توصيل ضاغط الهواء وتشغيله.
- لفتح نافذة الاكتساب، افتح التجربة التي تم إنشاؤها.
- اختر الاستحواذ | الاستحواذ المفتوح.
- ضع الماوس مع المعرف المشار إليه بواسطة البرنامج في مربع هدف البداية (الجانب الأيمن من السلم).
- حدد معرف الماوس للحصول عليه في الجلسة الأولى.
- انقر فوق بدء الاستحواذ.
- اضغط على مقبض قائمة السلم الأحمر 3x. تحقق من بدء الجلسة والتحكم تلقائيا في حركات الماوس وتسجيلها حتى نهاية الإصدار التجريبي الأخير من الجلسة.
- قم بإنهاء الجلسة.
- تحقق من أنه فينهاية الإصدار التجريبي 42 ، تعرض الشاشة الرسائل إرسال البيانات والمكتسبة.
- أعد الماوس إلى قفص المنزل.
- تنظيف السلم ومربعات الهدف.
- ضع الماوس التالي وكرر من الخطوة 2.2.6 فصاعدا.
- قم بإجراء نوع الجلسة المحدد كل يوم حتى نهاية البروتوكول. كرر الخطوتين 2.2 و 2.3 كل يوم وفقا للبروتوكول المحدد.
- تصدير البيانات (الشكل التكميلي S2).
- لتصور البيانات المسجلة، اختر من قائمة التحليل وإحصائيات الإصدار التجريبي وإحصائيات الجلسة وإحصائيات المجموعة والمخططات.
ملاحظة: يمكن تنزيل البيانات كجدول بيانات يحتوي على بيانات للتجارب الفردية ووسائل نفس أنواع التجارب داخل الجلسة. يمكن أيضا تصفية الجلسات حسب المتغيرات المختارة لتحليل محدد. - انقر فوق الزر تصدير في الزاوية العلوية اليمنى لاختيار تنسيق الملف (جدول البيانات) وموقع المجلد.
- انقر بزر الماوس الأيمن على المخططات التي تم إنشاؤها تلقائيا وحدد حفظ في ملف ك * .jpg.
- لتصور البيانات المسجلة، اختر من قائمة التحليل وإحصائيات الإصدار التجريبي وإحصائيات الجلسة وإحصائيات المجموعة والمخططات.
3. تحليل البيانات
ملاحظة: يتم قياس قائمة المعلمات تلقائيا بواسطة سلم إيراسموس بناء على التسجيل الفوري لأنشطة المستشعرات الحساسة للمس. للتحليل ، يتم تنظيم معلمات الإخراج التي حددها المستخدم ومعالجتها في جداول البيانات. إلى جانب الرسوم البيانية التي تم إنشاؤها بواسطة البرامج ، يمكن للمستخدمين إنشاء رسوم بيانية باستخدام برنامج الرسوم البيانية المفضل لتصور تغييرات محددة في معلمات مختلفة على مدار الجلسات.
- اختر معلمات محددة لتحليل الدافع الأساسي أو حالات القلق ، والاستجابات الحسية ، والأداء الحركي ، والتعلم الحركي الدقيق خلال أول 4 أيام.
- حدد معلمات التحكم ورسمها ، بما في ذلك وقت الراحة في مربع الهدف ووقت الخروج من مربع الهدف بعد فترة الراحة استجابة لإشارات الضوء والهواء (الشكل 2 أ).
ملاحظة: أوقات الراحة أو الاستجابة للإشارات ثابتة نسبيا في الفئران WT. المعلمات الأخرى مثل تواتر المخارج لا تكاد تذكر في الفئران WT - نادرا ما تترك صندوق الراحة بدون إشارات أو تعود مرة واحدة في السلم ، مما يؤدي إلى ترددات خروج تساوي 1 لكل تجربة. إذا خرج قبل تطبيق الإشارات ، يتم تنشيط تدفق الهواء مما يجبر الماوس على العودة إلى مربع الهدف ؛ لا يتم احتساب هذا كتجربة بواسطة البرنامج. - حدد الوقت على السلم وارسمه بعد الإشارات ، ويقاس بالوقت المستغرق في عبور السلم بمجرد مغادرة الماوس لمربع الهدف (الشكل 2 ب).
ملاحظة: يعد الانحدار غير الخطي للقوة طريقة قوية لتقييم التعلم. سيوفر معامل بيرسون أو سبيرمان (R) مقياسا لما إذا كان ملاءمة البيانات جيدا (قيم R قريبة من واحد عندما تتعلم / تتحسن خلال الجلسات ؛ تشير قيم R القريبة من 0 إلى أن البيانات ثابتة وأن الفئران لا تتعلم). - حدد ورسم معلمات نمط الخطوة مثل النسبة المئوية للتجارب ذات العثرات كمعلمة تعلم حساسة (الشكل 2C).
- حدد الخطوة الصحيحة كخطوة من درجة عالية إلى درجة عالية أخرى (H-H) ، بغض النظر عن طول الخطوة. ضع في اعتبارك أنواع الخطوات التي تتضمن درجة أقل كعثرات.
- قسم الخطوات والأخطاء الصحيحة إلى خطوات قصيرة وطويلة ، وخطوات خلفية ، وقفزات اعتمادا على طول واتجاه الخطوة بين الدرجات المضغوطة (انظر الشكل 1 أ).
- حدد معلمات التحكم ورسمها ، بما في ذلك وقت الراحة في مربع الهدف ووقت الخروج من مربع الهدف بعد فترة الراحة استجابة لإشارات الضوء والهواء (الشكل 2 أ).
- حدد ورسم معلمات محددة لتقييم التعلم الحركي الذي تم تحديه (التجارب الأمريكية فقط) والتعلم الترابطي (التجارب المقترنة) على مدار آخر 4 أيام.
- حدد وارسم الوقت على السلم بعد الإشارات (الشكل 3).
- حدد وارسم النسبة المئوية للتجارب ذات العثرات (الشكل 4 أ).
- حدد وارسم أوقات خطوة الاضطراب قبل وبعد ، والتي تعرف بأنها فرق دقة مللي ثانية بين تنشيط الدرجة قبل (خطوة التحكم) مباشرة وبعد العائق (الخطوة المعدلة) على نفس الجانب من السلم (الشكل 4 ب).
ملاحظة: يجب إجراء تحليل أوقات الخطوات قبل الاضطراب مقابل بعده لمقارنة البيانات داخل كل نوع من أنواع الجلسات. تقيس المعلمة قدرة الفئران على التنبؤ والتغلب على العقبات أثناء التعلم الترابطي.
- تحليل البيانات باستخدام برنامج إحصائي مخصص (على سبيل المثال ، SigmaPlot). قم بإجراء تحليل الانحدار غير الخطي للبيانات التي تم جمعها من نفس نوع التجربة عبر الجلسات لوصف عملية التعلم بشكل أكثر كفاءة واستخدام ANOVA للمقاييس المتكررة ثنائية الاتجاه (RM) للمقارنة بين أنواع التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض جهاز Erasmus Ladder والإعداد والبروتوكول المطبق في الشكل 1. يتكون البروتوكول من أربع جلسات دون إزعاج وأربع جلسات تحدي (42 محاكمة لكل منها). كل تجربة هي جولة واحدة على السلم بين مربعات البداية والنهاية. في بداية الجلسة ، يتم وضع الماوس في أحد مربعات البداية. بعد وقت محدد من 15 ± 5 ثوان (حالة "الراحة") ، يتم تشغيل الضوء (جديلة 1 ، بحد أقصى 3 ثوان). ثم يتم تطبيق إشارة هواء خفيفة (جديلة 2 ، 45 ثانية كحد أقصى) لتشجيع الفئران على مغادرة الصندوق والمشي إلى الطرف الآخر. يمكن أن يختلف وقت الاستجابة لإشارة الهواء بين الفئران والجلسات ويمكن استخدامه كمعلمة لمقارنة حالات الدافع أو القلق بين المجموعات. يتم بدء إصدار تجريبي جديد على الفور بعد وصول الماوس إلى مربع هدف النهاية.
لم تلاحظ أي فروق في وقت الراحة ووقت الاستجابة لإشارة الضوء في الفئران WT خلال الأيام 1-4 ، ولكن وقت الاستجابة لإشارة الهواء انخفض قليلا بين اليومين 1 و 2 (الشكل 2 أ). أسفرت قياسات الوقت لعبور السلم عن منحنى تعليمي مهم من الأيام 1 إلى 4 يمكن تزويده بمنحنى انحدار الطاقة (R = 0.50 ، * p = 0.047 ، الشكل 2B). المعلمة الرئيسية التي تحدد الوقت المستغرق لعبور السلم هي حدوث العثرات. تماشيا مع تقصير الأوقات على السلم ، انخفض عدد التجارب التي ارتكبت فيها الفئران أخطاء خلال الجلسات غير المضطربة حيث تعلمت الفئران المشي على الدرجات العليا (خطوات H-H) وتجنب الدرجات السفلية كنمط أكثر كفاءة لعبور السلم (R = 0.90 ، ***p < 0,0001 ، الشكل 2C).
من الأيام 5 إلى 8 ، تعرضت الفئران لجلسات تحدي حيث تم إدخال عقبة غير متوقعة (الولايات المتحدة) (يتم رفع درجة واحدة بشكل عشوائي بمقدار 18 مم فوق سطح الخطو). في بعض التجارب ، يتم تقديم نغمة (CS ، 90 ديسيبل ، نغمة 15 كيلو هرتز تدوم 250 مللي ثانية) قبل 250 مللي ثانية من اضطراب الولايات المتحدة (انظر الشكل 1B).
مع بداية جلسات التحدي في اليوم الخامس ، احتاجت إلى مزيد من الوقت لعبور السلم خلال التجارب الأمريكية فقط بسبب الإدخال غير المتوقع للعقبة (اليوم 4: 5.01 ثانية ؛ الشكل 2 ب ؛ اليوم 5: 7.84 ثانية ؛ الشكل 3 ؛ اختبار t المقترن ، * P < 0.039). تحسن أداء الماوس من الأيام 5 إلى 8 ، مما أدى إلى منحنى تعليمي كبير عبر الجلسات في الولايات المتحدة فقط (R = 0.50 ، * p = 0.045 ، الشكل 3 ، برتقالي). في تجارب التعلم الترابطي ، حيث تم إقران العقبة بنبرة ، أكملت الجلسات اليومية بشكل أسرع بكثير مقارنة بالتجارب الأمريكية فقط (R = 0.63 ، الشكل 3 ، أرجواني ؛ ثنائي الاتجاه RM ANOVA ، * p = 0.028). أخيرا ، في التجارب الضابطة عندما تم تقديم النغمة بمفردها (CS فقط) ، تم الإبلاغ عن منحنى تعليمي مهم يشبه الجلسات غير المضطربة (R = 0.82 ، ***p < 0.001 ، الشكل 3 ، أزرق).
قدم تحليل أنماط الخطوات تأكيدا إضافيا وحساسية معززة في اكتشاف الاختلافات بين التجارب الأمريكية فقط والتجارب الترابطية. يوضح الشكل 4 أ كيف ظلت النسبة المئوية للتجارب التي تنطوي على عثرات ثابتة طوال التجارب في الولايات المتحدة فقط (R = 0.01 ، p = 0.90 ، برتقالي) ، بينما لوحظ انخفاض كبير في التجارب ذات العثرات أثناء الجلسات المزدوجة (R = 0.61 ، * p = 0.01 ، أرجواني). يوضح الشكل 4B فرقا كبيرا بين أوقات خطوات الاضطراب قبل وبعد الاضطراب في التجارب الأمريكية فقط (RM ANOVA ثنائي الاتجاه ، * p = 0.05) ولكن ليس في التجارب المزدوجة حيث تعلمت الفئران بشكل أسرع للتغلب على العقبة. يتم الإبلاغ عن جميع المتغيرات التي تمت دراستها والاختبارات الإحصائية المطبقة في الجدول التكميلي S1.
الشكل 1: النظام والبروتوكول والمعلمات. (أ) يتكون سلم إيراسموس من سلم أفقي يحيط به صندوقان للمرمى. يمثل الكارتون السلم مع درجات عالية ومنخفضة بالتناوب والمعلمات الرئيسية المسجلة ، بما في ذلك أنواع الخطوات (الخطوات العادية ، الخط المملوء ؛ أو العثرات ، الخط المتقطع) ووقت خطوة الاضطراب قبل وبعد يعرف بأنه الوقت الذي يحتاجه الماوس للتغلب على عقبة (حافز غير مشروط ؛ درجة أعلى) معلنة أم لا بنغمة (حافز مشروط). (ب) يتكون البروتوكول من أربع جلسات تحدي غير مضطربة وأربع جلسات تحدي (جلسة واحدة / يوم ، 42 تجربة / جلسة) تسمح بتحليل التعلم الحركي الدقيق بشكل منفصل (بدون إزعاج و CS فقط باللون الأزرق) ، والتعلم الحركي المتحدي (الولايات المتحدة فقط ، باللون البرتقالي) ، والتعلم الحركي الترابطي (CS + US المقترن ، باللون الأرجواني). الاختصارات: H = مرتفع ؛ L = منخفض ؛ CS = التحفيز المشروط ؛ الولايات المتحدة = التحفيز غير المشروط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأداء الحركي لفئران WT أثناء الجلسات غير المضطربة. (أ) وقت الراحة في صندوق المرمى (ثابت ، 15 ثانية) ، وقت الاستجابة للإشارات: الضوء (ثابت ، 3 ثوان) والهواء (متغير) ؛ على مدى أيام 1-4 من الجلسات دون عائق. (ب) وقت لعبور السلم بعد الإشارة (الضوء والهواء) أثناء الجلسات غير المضطربة. (ج) النسبة المئوية للتجارب في كل جلسة غير مضطربة حيث غاب عن خطوة. تم استخدام تحليل انحدار الطاقة لدراسة تقدم التعلم (R = 0.50: * p = 0.047 ، R = 0.90 *** p < 0.0001 ، على التوالي ، n = 4 فئران). اختصار: WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أداء الفئران WT أثناء جلسات التحدي. متوسط الوقت على السلم بعد الإشارات خلال الأيام 5-8 لتجارب الولايات المتحدة فقط (برتقالي) ومزدوجة (أرجوانية) و CS فقط (أزرق فاتح). تم استخدام تحليل الانحدار غير الخطي للطاقة لدراسة تقدم التعلم (* p = 0.047 ، ** p = 0.0093 ، ***p < 0.001 ، n = 4 فئران). ثنائي الاتجاه RM ANOVA لمقارنة أنواع التجارب (* p = 0.028 ، ** p = 0.008 ، n = 4 فئران ، ذكران وإناثان ، يعني ± SEM). الاختصارات: CS = التحفيز المشروط ؛ الولايات المتحدة = التحفيز غير المشروط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التغييرات في أنماط خطوات الماوس خلال جلسات التحدي. (أ) النسبة المئوية للتجارب لكل جلسة حيث غاب عن خطوة خلال الجلسات الأمريكية فقط والجلسات المزدوجة. تم استخدام تحليل انحدار الطاقة لدراسة عملية التعلم (* p = 0.013) و RM ANOVA ثنائي الاتجاه للمقارنة بين أنواع التجارب (* p = 0.032 ، n = 4 فئران). (ب) وقت (أوقات) خطوة ما قبل الاضطراب وبعده في جلسات الولايات المتحدة فقط والجلسات المزدوجة طوال الجلسات. التدابير المتكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، * p < 0.05 ، n = 4 فئران ، ذكران وإناثان ، تعني ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: واجهة البرنامج: كيفية إنشاء تجربة واختيار بروتوكول. لقطات شاشة من البرنامج توضح سير العمل الموضح في خطوة البروتوكول 2.1 ، والتي تغطي الخطوات من 2.1.4 إلى 2.1.8. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: واجهة البرنامج: كيفية بدء الجلسة وتصدير البيانات. لقطات شاشة من البرنامج توضح سير العمل الموضح في الخطوتين 2.2 و2.5 من البروتوكول ، والتي تغطي الخطوات 2.2.4 إلى 2.2.7 و 2.5.1 إلى 2.5.3. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S1: الجدول الإحصائي. وصف جميع المتغيرات التي تمت دراستها والاختبارات الإحصائية المطبقة ، المبلغ عنها في الشكل 2B ، C ، الشكل 3 ، والشكل 4A ، B. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم سلم إيراسموس مزايا كبيرة لتقييم النمط الظاهري الحركي بما يتجاوز الأساليب الحالية. الاختبار سهل الإجراء ، وآلي ، وقابل للتكرار ، ويسمح للباحثين بتقييم الجوانب المختلفة للسلوك الحركي بشكل منفصل باستخدام مجموعة فأر واحدة. في الدراسة الحالية ، سمحت قابلية التكاثر بتوليد بيانات قوية مع عدد صغير من فئران WT مع الاستفادة من ميزات الجهاز والتصميم التجريبي وطرق التحليل. على سبيل المثال ، عند مقارنتها بمقايسات المشي التقليدية ، فإن إضافة إشارات تحفيزية (الهواء والضوء) لدخول مسار السلم والرياح الخلفية لإكمال التجربة تزيد من الاتساق وتتخطى الحاجة إلى تدخل المجرب الذي يعد مصدرا رئيسيا للتباين.
مطلوب نظام ضاغط الهواء لتوليد تدفق هواء يمكن ضبطه وفقا لاتجاه الماوس وموضعه. يخلق تدفق الهواء رياحا معاكسة تبلغ 30 كم / ساعة من الاتجاه المعاكس عندما يحاول الماوس مغادرة مربع الهدف قبل بدء التجربة المجدولة ، مما يجعل الفئران تعود إلى مربع المرمى. كما أنه يولد رياحا خلفية ثابتة (من 1 إلى 16 كم / ساعة) أثناء التجربة حتى يعبر الماوس السلم تماما ويدخل مربع المرمى المعاكس. بدون الهواء المضغوط كحافز لعبور السلم ، تتوقف الفئران في كثير من الأحيان على الدرجات وتعكس الاتجاهات بوتيرة مريحة ، مما يؤدي إلى متغير استكشافي يؤدي إلى نتائج عكسية للتحليل.
يوفر البروتوكول القياسي الموصوف هنا قياسات للتنسيق الحركي الدقيق الأساسي والتعلم (الجلسات غير المضطربة) ، بالإضافة إلى التكيف مع التحديات والتعلم الحركي الترابطي (جلسات التحدي) على مدى فترة زمنية مدتها 8 أيام. المهمة سهلة بالنسبة لسلالات الفئران WT المستخدمة عادة في دراسات علم الأعصاب مثل الفئران C57Bl6J المستخدمة هنا ، وهي آمنة ، دون ملاحظة أي إصابات في أي من جلسات الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، لم نكتشف علامات التعب عند مقارنتها بالاختبارات الحركية الأخرى مثل الروتارود أو جهاز المشي.
خلال المرحلة الأولية التي تستغرق 4 أيام ، تتقن فئران WT المهارة وتعبر السلم من خلال تعلم تبني نمط الجري الأكثر كفاءة (خطوات H-H) ونادرا ما تحدث العثرات بحلول اليوم 4 (الشكل 2B ، C). في اليوم 5 من المرحلة الثانية ، تكون الفئران أبطأ عندما تواجه العقبة لأول مرة ولكنها تتكيف بسرعة (الشكل 3 ، الولايات المتحدة فقط). إن اقتران العائق بمحفز تكييف (نغمة) يسهل التعلم إلى الحد الذي تساوي فيه مدة التجربة التجارب حيث لا يتم تقديم العقبة (الشكل 3 ، مقترن). وتجدر الإشارة إلى أن عدد التجارب التي تنطوي على عثرات ظل ثابتا طوال التجارب في الولايات المتحدة فقط (الشكل 4 أ)، في حين لوحظ انخفاض كبير في الجلسات المزدوجة (الشكل 4 أ)، مما يؤكد فعالية عملية التعلم الترابطي.
نقترح سير عمل لتحليل المعلمات التمثيلية التي يوفرها برنامج Erasmus Ladder. سمح لنا تحليل انحدار الطاقة بتسجيل منحنيات تعلم مهمة واكتشاف الاختلافات في التعلم الذي تم تحديه مقابل التعلم الترابطي باستخدام أربعة فئران WT. استنادا إلى الأدبيات الإضافية والتجارب التجريبية ، قد تتطلب التصميمات التجريبية التي تشمل الفئران الطافرة أو المعالجة زيادة أعداد الفئران إلى 7-10 فئران4،5،6. في أيدينا ، كانت 42 تجربة لكل جلسة هي الرقم الأمثل للحصول على بيانات قوية مع مجموعة فأر صغيرة لأن متوسط العديد من التجارب يقلل من التباين. في حين أن العدد قد يبدو مرتفعا ، فإن كل جلسة تجريبية من 42 تستغرق ما بين 15 دقيقة و 35 دقيقة ، ويمكن اختبار 12-16 فأرا بشكل معقول يوميا. تتراوح مدة التجربة (بما في ذلك وقت الراحة والاستجابة للإشارات بالإضافة إلى الوقت لاجتياز السلم) بين 20 ثانية و 50 ثانية ، اعتمادا على يوم التدريب ونوع التجربة.
ومع ذلك ، فإن تعدد استخدامات النظام سيسمح للباحثين بتصميم بروتوكولات مخصصة عن طريق ضبط الإعدادات المختلفة ، بما في ذلك عدد الجلسات والتجارب في اليوم ، وكثافة ومدة الإشارات و CS ، بالإضافة إلى طبيعة الولايات المتحدة. على سبيل المثال ، أظهرت بياناتنا منحنى تعلم سريع في الفئران WT ، خاصة بين اليوم 1 واليوم 2 بعد وصول الأداء إلى هضبة (الأشكال 2B ، C). هذا يشير إلى أن يومين إضافيين قد لا يكونان ضروريين للغاية لاختبار التعلم الحركي الأساسي في جلسات غير مضطربة ، ويمكن تنفيذ تعديلات على البروتوكول القياسي عن طريق تقليل مدة التدريب إلى يومين فقط. ومع ذلك ، قد لا يكون هذا التكيف مناسبا للمرحلة الثانية من البروتوكول ، والتي تتضمن تجارب متداخلة غير مضطربة ، وتجارب أمريكية فقط ، و CS فقط ، وتجارب مزدوجة. يتم تقديم المحفزات بشكل عشوائي وغير متوقع لتقييم سلوكيات محددة ، والحاجة إلى تقسيم التجارب التجريبية إلى هذه الفئات الأربع تجعل 42 عددا مناسبا من التجارب المطلوبة للقوة الإحصائية. ومن ثم، فإن إعادة تنظيم البروتوكول ستحتاج إلى تقييم جدوى خفض عدد المحاكمات غير المضطربة أو زيادة محاكمات طعن محددة. يمكن أيضا تغيير فترة التحفيز البيني (ISI) بين CS (90 ديسيبل ، نغمة 15 كيلو هرتز) والولايات المتحدة ، هنا محددة عند 250 مللي ثانية ، لدراسة ارتباط التحفيز والاستجابة. سيسمح هذا النوع من التعديل للباحثين بمعايرة مستوى الصعوبة أو التركيز على سلوكيات مختلفة وفقا للسؤال العلمي.
حتى الآن ، تم استخدام سلم إيراسموس في الغالب للكشف عن العيوب الدقيقة في التنسيق الحركي للأصل المخيخي. على سبيل المثال ، العثرات هي مقياس للتنسيق الحركي لكامل الجسم. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة الشابة ولكن تم استخدام الفئران الصغيرة مثل P23 من قبل الآخرين لدراسة نضج الوظائف الحركية 7,8. يمكن دراسة الأمراض المماثلة ذات الأصل المركزي من خلال التحليل التمييزي لموضع الكفوف اليمنى واليسرى للفأر. أخيرا ، من المحتمل أن يؤدي إتقان المهارات الحركية في سلم إيراسموس إلى إشراك دوائر التحكم الحركي الأخرى ، بما في ذلك العقد القاعدية ، والقشرة الحركية ، ومسارات التوصيل ، بما في ذلك الجسم الثفني. سيكون الجمع بين هذا النموذج السلوكي والتقنيات الخلوية والجزيئية والدوائر مفيدا للتحقيق في آليات الدائرة التي تتوسط التكيف الحركي ويمكن تسخيرها لتعزيز التعلم الحركي. أحد الأمثلة على ذلك هو دراسة التأثير على الميالين المحوري ، وهو حساس للغاية لاكتساب المهارات الحركية الدقيقة في نماذج الفئران لإزالة الميالين 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نعرب عن تقديرنا للفني السمعي البصري ومنتج الفيديو ريبيكا دي لاس هيراس بونس وكذلك كبير الأطباء البيطريين غونزالو مورينو ديل فال ، للإشراف على الممارسة الجيدة أثناء تجربة الفئران. تم تمويل العمل من خلال منح من برنامج التميز GVA (2022/8) ووكالة الأبحاث الإسبانية (PID2022143237OB-I00) إلى إيزابيل بيريز أوتانيو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- Noldus. , https://www.noldus.com/erasmusladder (2023).
- Cupido, A., et al. Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , Erasmus University Rotterdam PhD dissertation. (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
