Monitoring van fijn en associatief motorisch leren bij muizen met behulp van de Erasmusladder

Summary

Dit artikel presenteert een protocol dat een niet-invasieve en geautomatiseerde beoordeling van fijne motorische prestaties mogelijk maakt, evenals adaptief en associatief motorisch leren bij uitdagingen, met behulp van een apparaat genaamd de Erasmusladder. De moeilijkheidsgraad van de taak kan worden getitreerd om motorische stoornissen te detecteren, variërend van grote tot subtiele gradaties.

Abstract

Gedrag wordt gevormd door acties, en acties vereisen motorische vaardigheden zoals kracht, coördinatie en leren. Geen van de gedragingen die essentieel zijn voor het in stand houden van het leven zou mogelijk zijn zonder het vermogen om van de ene positie naar de andere over te gaan. Helaas kunnen motorische vaardigheden worden aangetast bij een breed scala aan ziekten. Daarom is het onderzoeken van de mechanismen van motorische functies op cellulair, moleculair en circuitniveau, evenals het begrijpen van de symptomen, oorzaken en progressie van motorische stoornissen, cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen. Hiervoor worden vaak muismodellen gebruikt.

Dit artikel beschrijft een protocol dat het mogelijk maakt om verschillende aspecten van motorische prestaties en leren bij muizen te monitoren met behulp van een geautomatiseerd hulpmiddel genaamd de Erasmusladder. De test omvat twee fasen: een eerste fase waarin muizen worden getraind om te navigeren op een horizontale ladder die is opgebouwd uit onregelmatige sporten ("fijne motoriek"), en een tweede fase waarin een obstakel wordt gepresenteerd op het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn ('uitgedaagd motorisch leren') of worden voorafgegaan door een auditieve toon ('associatief motorisch leren'). De taak is eenvoudig uit te voeren en wordt volledig ondersteund door geautomatiseerde software.

Dit rapport laat zien hoe verschillende uitlezingen van de test, wanneer geanalyseerd met gevoelige statistische methoden, een nauwkeurige monitoring van de motoriek van muizen mogelijk maken met behulp van een klein cohort muizen. We stellen voor dat de methode zeer gevoelig zal zijn voor het evalueren van motorische aanpassingen die worden aangedreven door veranderingen in de omgeving, evenals subtiele motorische tekorten in een vroeg stadium bij gemuteerde muizen met gecompromitteerde motorische functies.

Introduction

Er zijn verschillende tests ontwikkeld om motorische fenotypes bij muizen te beoordelen. Elke test geeft informatie over een specifiek aspect van motorisch gedrag¹. De open veldtest informeert bijvoorbeeld over de algemene motoriek en angsttoestand; de rotarod- en loopbalktests op coördinatie en evenwicht; Voetafdrukanalyse gaat over lopen; de loopband of het loopwiel bij gedwongen of vrijwillige lichaamsbeweging; En het complexe wiel gaat over het leren van motorische vaardigheden. Om motorische fenotypes van muizen te analyseren, moeten onderzoekers deze tests opeenvolgend uitvoeren, wat veel tijd en moeite kost en vaak meerdere diercohorten. Als er informatie is op cellulair of circuitniveau, kiest de onderzoeker normaal gesproken voor een test die een gerelateerd aspect bewaakt en van daaruit volgt. Het ontbreekt echter aan paradigma's die verschillende aspecten van motorisch gedrag op een geautomatiseerde manier onderscheiden.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van de Erasmus Ladder ^2,3, een systeem dat een uitgebreide beoordeling van een verscheidenheid aan motorische leerkenmerken bij muizen mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen zijn de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de methode, samen met het vermogen om motorische moeilijkheden te titreren en om tekorten in motorische prestaties te scheiden van verminderd associatief motorisch leren. Het hoofdonderdeel bestaat uit een horizontale ladder met afwisselend hoge (H) en lage (L) sporten uitgerust met aanraakgevoelige sensoren die de positie van de muis op de ladder detecteren. De ladder is gemaakt van 2 x 37 sporten (L, 6 mm; H, 12 mm) op een onderlinge afstand van 15 mm en in een afwisselend patroon van links naar rechts met tussenruimten van 30 mm (figuur 1A). Sporten kunnen afzonderlijk worden verplaatst om verschillende moeilijkheidsgraden te genereren, dat wil zeggen een obstakel creëren (de hoge sporten met 18 mm verhogen). In combinatie met een geautomatiseerd registratiesysteem en het associëren van modificaties van het sportpatroon met sensorische stimuli, test de Erasmus-ladder voor fijn motorisch leren en aanpassing van motorische prestaties als reactie op omgevingsuitdagingen (verschijnen van een hogere sport om een obstakel te simuleren, een ongeconditioneerde stimulus [VS]) of associatie met sensorische stimuli (een toon, een geconditioneerde stimulus [CS]). Het testen omvat twee verschillende fasen, die elk de verbetering van de motorische prestaties gedurende 4 dagen beoordelen, waarin muizen een sessie van 42 opeenvolgende proeven per dag ondergaan. In de beginfase worden muizen getraind om door de ladder te navigeren om "fijn" of "bekwaam" motorisch leren te beoordelen. De tweede fase bestaat uit interleaved proeven waarbij een obstakel in de vorm van een hogere sport wordt gepresenteerd in het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn om "uitgedaagd" motorisch leren te beoordelen (alleen in de VS onderzocht) of aangekondigd door een auditieve toon om "associatief" motorisch leren te beoordelen (gepaarde onderzoeken).

De Erasmusladder is relatief recent ontwikkeld ^2,3. Het is niet op grote schaal gebruikt omdat het opzetten en optimaliseren van het protocol gerichte inspanning vergde en specifiek was ontworpen om cerebellair-afhankelijk associatief leren te beoordelen zonder in detail het potentieel ervan te onderzoeken om andere motorische stoornissen aan het licht te brengen. Tot op heden is het gevalideerd voor zijn vermogen om subtiele motorische stoornissen te onthullen die verband houden met cerebellaire disfunctie bij muizen 3,4,5,6,7,8. Bijvoorbeeld, connexine36 (Cx36) knock-out muizen, waar gap junctions zijn aangetast in olivaire neuronen, vertonen vuurtekorten als gevolg van een gebrek aan elektrotonische koppeling, maar het motorfenotype was moeilijk te lokaliseren. Testen met behulp van de Erasmus-ladder suggereerden dat de rol van inferieure olivaire neuronen in een cerebellaire motorische leertaak is om nauwkeurige temporele codering van stimuli te coderen en leerafhankelijke reacties op onverwachte gebeurtenissen te vergemakkelijken ^3,4. Fragile X Messenger Ribonucleoproteïne 1 (Fmr1) knock-out muis, een model voor Fragile-X-Syndrome (FXS), vertoont een bekende cognitieve stoornis samen met mildere defecten in procedurele geheugenvorming. Fmr1-knock-outs vertoonden geen significante verschillen in staptijden, misstappen per proef of verbetering van de motorische prestaties tijdens sessies in de Erasmus-ladder, maar slaagden er niet in hun looppatroon aan te passen aan het plotseling verschijnende obstakel in vergelijking met hun wild-type (WT) nestgenoten, wat specifieke procedurele en associatieve geheugentekorten bevestigt ^3,5. Bovendien vertoonden celspecifieke mutante muizenlijnen met defecten in de cerebellaire functie, waaronder verminderde output van Purkinje-cellen, potentiëring en interneuron- of korrelceloutput van de moleculaire laag, problemen in de motorische coördinatie met veranderde verwerving van efficiënte stappatronen en in het aantal stappen dat werd gezet om de ladder over te steken⁶. Neonataal hersenletsel veroorzaakt cerebellaire leerachterstanden en Purkinje-celdisfunctie die ook met de Erasmusladder ^7,8 konden worden opgespoord.

In deze video presenteren we een uitgebreide stap-voor-stap handleiding, waarin de inrichting van de gedragskamer, het gedragstestprotocol en de daaropvolgende gegevensanalyse worden beschreven. Dit rapport is opgesteld om toegankelijk en gebruiksvriendelijk te zijn en is speciaal ontworpen om nieuwkomers te helpen. Dit protocol geeft inzicht in verschillende fases van motorische training en verwachte motorische patronen die muizen aannemen. Ten slotte stelt het artikel een systematische workflow voor data-analyse voor met behulp van een krachtige niet-lineaire regressiebenadering, compleet met waardevolle aanbevelingen en suggesties voor het aanpassen en toepassen van het protocol in andere onderzoekscontexten.

Protocol

In de huidige studie werden volwassen (2-3 maanden oude) C57BL/6J-muizen van beide geslachten gebruikt. De dieren werden twee tot vijf per kooi gehuisvest met ad libitum toegang tot voedsel en water in een dierunit onder observatie en gehouden in een temperatuurgecontroleerde omgeving op een donker/licht-cyclus van 12 uur. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en Spaanse regelgeving (2010/63/UE; RD 53/2013) en werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Generalitat Valenciana en de commissie voor dierenwelzijn van de Universidad Miguel Hernández.

1. Gedragsmatige kameropstelling

1. Reserveer de gedragstestruimte elke dag op hetzelfde tijdstip en stel de lijst en volgorde van de te gebruiken muizen vast, evenals regelingen voor hun hosting.
2. Houd de experimentele muizen buiten de testruimte, zodat ze de geluiden van de luchtcompressor en de Erasmus Ladder-tonen niet horen wanneer ze niet worden getest.
3. Controleer of alle onderdelen van het Erasmus Ladder-systeem in orde en klaar voor gebruik zijn: de netwerkrouter, de computer met de software (zie Materiaaltabel), de luchtcompressor, twee doelkasten en de ladder met de sporten goed geplaatst.
4. Reinig de doelkasten, ladder en sporten uitgebreid met water na elk dier en met water en 70% ethanol aan het einde van elke trainingsdag.

2. Gedragstestprotocol

1. Maak een experiment en voer het protocol in de software in (aanvullende afbeelding S1).
   1. Zet de software aan.
   2. Als u een experiment wilt maken, kiest u Bestand | Nieuw experiment | Nieuw of ingesteld | Experiment protocol.
      OPMERKING: Het standaardprotocol dat in dit onderzoek wordt gebruikt, heet EMC en is ontworpen in het Erasmus Universitair Medisch Centrum, Rotterdam.
   3. Geef het experiment een naam en klik op OK.
   4. Controleer of het standaard geselecteerde EMC-protocol bestaat uit 4 dagen ongestoorde sessies (42 ongestoorde proeven per dag) en 4 dagen uitdagingssessies (42 dagelijkse gemengde proeven: ongestoord, alleen CS (toon), alleen VS (obstakel), Gekoppeld (obstakel aangekondigd door toon) (zie afbeelding 1B). Controleer in het rechterzijpaneel ook de lichtcue (maximale duur van 3 s), de luchtcue (maximale duur van 45 s) en de wind in de rug (Ja in alle soorten proeven), die worden gebruikt om de muis aan te moedigen de ladder over te steken, en de toon (250 ms, Ja alleen in CS-only en Paired-proeven).
   5. Als u een ander protocol wilt maken, kiest u Instellen | Experimenteerprotocol | Nieuw | Helemaal opnieuw of kopieer van het EMC-protocol en wijzig het eenvoudig, bewerk de tabelregels met betrekking tot het aantal sessies (experimenteerdagen) en het aantal en type proeven per dag.
      OPMERKING: Rusttijd, type cues en activering, duur, intensiteit en interval kunnen ook worden aangepast aan de experimentele vragen.
   6. Als u de sessielijst wilt openen en de onderwerpen een naam wilt geven, kiest u Instellen | Sessie lijst.
   7. Klik op Onderwerpen en variabelen toevoegen.
   8. Voer elke specifieke muisidentificatie, geboortedatum, geslacht, genotype en relevante categorieën in, volgens de geordende lijst met muizen.
2. Start de sessie (aanvullende figuur S2).
   1. Controleer voordat u begint of de software is geopend en schakel vervolgens de ladder in.
   2. Controleer of de luchtcompressor is aangesloten en ingeschakeld.
   3. Als u het venster Acquisitie wilt openen, opent u het gemaakte experiment.
   4. Kies Acquisitie | Open Acquisitie.
   5. Plaats de muis met de door de software aangegeven identifier in het startdoelvak (rechterkant van de ladder).
   6. Selecteer de muis-id die u in de eerste sessie wilt verkrijgen.
   7. Klik op Start Acquisitie.
   8. Druk 3x op de rode laddermenuknop . Controleer of de sessie wordt gestart en muisbewegingen automatisch worden bestuurd en geregistreerd tot het einde van de laatste proefversie van de sessie.
3. Beëindig de sessie.
   1. Controleer of aan het einde van de 42e^{proef de} berichten Gegevens verzenden en Verkregen op het display worden weergegeven.
   2. Plaats de muis terug in de thuiskooi.
   3. Reinig de ladder en de doeldozen.
   4. Plaats de volgende muis en herhaal vanaf stap 2.2.6.
4. Voer het geselecteerde type sessie elke dag uit tot het einde van het protocol. Herhaal stap 2.2 en 2.3 elke dag volgens het gekozen protocol.
5. Exporteer de gegevens (aanvullende afbeelding S2).
   1. Als u de opgenomen gegevens wilt visualiseren, kiest u uit het menu Analyse , Proefstatistieken, Sessiestatistieken en Groepsstatistieken en -grafieken.
      OPMERKING: Gegevens kunnen worden gedownload als een spreadsheet met gegevens voor individuele onderzoeken en de middelen van dezelfde soorten onderzoeken binnen een sessie. Sessies kunnen ook worden gefilterd op variabelen die zijn gekozen voor specifieke analyse.
   2. Klik op de knop Exporteren in de rechterbovenhoek en kies het bestandsformaat (spreadsheet) en de maplocatie.
   3. Klik met de rechtermuisknop op de automatisch gegenereerde grafieken en selecteer Opslaan in bestand als *.jpg.

3. Data-analyse

OPMERKING: Een lijst met parameters wordt automatisch gemeten door de Erasmus Ladder op basis van de onmiddellijke registratie van de activiteiten van de aanraakgevoelige sensoren. Voor analyse worden de door de gebruiker geselecteerde uitvoerparameters georganiseerd en verwerkt in de spreadsheets. Samen met de door software gegenereerde grafieken kunnen gebruikers grafieken genereren met behulp van de grafische software naar keuze om specifieke veranderingen in verschillende parameters tijdens sessies te visualiseren.

1. Kies specifieke parameters om basale motivatie of angsttoestanden, sensorische reacties, motorische prestaties en fijne motoriek gedurende de eerste 4 dagen te analyseren.
   1. Selecteer en plot controleparameters, waaronder de rusttijd in het doelvak en de tijd om het doelvak te verlaten na de rustperiode als reactie op licht- en luchtsignalen (Figuur 2A).
      OPMERKING: Rusttijden of reactie op signalen zijn relatief constant bij WT-muizen. Andere parameters, zoals de frequentie van uitgangen, zijn in principe te verwaarlozen bij WT-muizen - de dieren verlaten zelden de rustbox zonder de signalen of komen één keer terug in de ladder, wat resulteert in uitgangsfrequenties die gelijk zijn aan 1 per proef. Als een dier naar buiten gaat voordat er aanwijzingen worden gegeven, wordt een luchtstroom geactiveerd die de muis dwingt terug te keren naar het doelgebied; Dit wordt door de software niet als een proefversie beschouwd.
   2. Selecteer en plot de tijd op de ladder na aanwijzingen, gemeten als de tijd die wordt besteed aan het oversteken van de ladder zodra de muis het doelvak verlaat (Figuur 2B).
      OPMERKING: Een niet-lineaire vermogensregressie is een robuuste methode voor het evalueren van leren. De Pearson- of Spearman-coëfficiënten (R) geven een maatstaf voor de vraag of de gegevensaanpassing goed is (R-waarden dicht bij één wanneer de dieren leren/verbeteren tijdens sessies; R-waarden in de buurt van 0 impliceren dat de gegevens constant zijn en dat muizen niet leren).
   3. Selecteer en plot parameters voor stappatronen , zoals het percentage proeven met misstappen , als een gevoelige leerparameter (Figuur 2C).
      1. Definieer een juiste trede als een trede van een hoge trede naar een andere hoge trede (H-H), ongeacht de lengte van de trede. Beschouw staptypen met een lagere sport als misstappen.
      2. Verdeel de juiste stappen en misstappen in korte en lange stappen, achterwaartse stappen en sprongen, afhankelijk van de lengte en richting van de stap tussen de ingedrukte sporten (zie figuur 1A).
2. Selecteer en plot specifieke parameters om uitgedaagd motorisch leren (alleen in de VS onderzoeken) en associatief leren (gepaarde onderzoeken) in de afgelopen 4 dagen te evalueren.
   1. Selecteer en plot de tijd op de ladder na aanwijzingen (Figuur 3).
   2. Selecteer en plot het percentage proeven met misstappen (Figuur 4A).
   3. Selecteer en plot de staptijden voor en na de verstoring, gedefinieerd als een ms-precisieverschil tussen de activering van de sport net voor (controlestap) en na het obstakel (aangepaste trede) aan dezelfde kant van de ladder (figuur 4B).
      OPMERKING: Er moet een analyse van de staptijden voor en na de verstoring worden uitgevoerd om de gegevens binnen elk type sessie te vergelijken. De parameter meet het vermogen van de muizen om de obstakels tijdens associatief leren te voorspellen en te overwinnen.
3. Analyseer de gegevens met speciale statistische software (bijv. SigmaPlot). Voer een krachtige niet-lineaire regressieanalyse uit van gegevens die zijn verzameld van hetzelfde proeftype in verschillende sessies om het leerproces efficiënter te beschrijven en gebruik Two-Way Repeated Measures (RM) ANOVA om verschillende soorten onderzoeken te vergelijken.

Representative Results

Het toegepaste apparaat van de Erasmus Ladder, de opstelling en het toegepaste protocol worden weergegeven in figuur 1. Het protocol bestaat uit vier ongestoorde en vier challenge-sessies (elk 42 proeven). Elke proef is één run op de ladder tussen het start- en einddoelvak. Aan het begin van de sessie wordt een muis in een van de startvakken geplaatst. Na een ingestelde tijd van 15 ± 5 s ("rusttoestand") wordt het licht ingeschakeld (cue 1, voor maximaal 3 s). Een lichte luchtcue (cue 2, maximaal 45 s) wordt vervolgens toegepast om de muizen aan te moedigen de doos te verlaten en naar de andere kant te lopen. De tijd om te reageren op de luchtcue kan variëren tussen muizen en sessies en kan worden gebruikt als een parameter om motivatie- of angsttoestanden tussen groepen te vergelijken. Een nieuwe proef wordt onmiddellijk gestart nadat de muis het einddoelvak heeft bereikt.

Er werden geen verschillen waargenomen in rusttijd en tijd om te reageren op de lichtcue bij WT-muizen op dag 1-4, maar de tijd om te reageren op de luchtcue nam licht af tussen dag 1 en 2 (Figuur 2A). Metingen van de tijd om de ladder te passeren leverden een significante leercurve op van dag 1 tot 4 die kon worden uitgerust met een vermogensregressiecurve (R = 0,50, *p = 0,047, Figuur 2B). Een belangrijke parameter die de tijd bepaalt die nodig is om de ladder over te steken, is het optreden van misstappen. In lijn met de verkorting van de tijden op de ladder, nam het aantal proeven waarbij muizen misstappen maakten af tijdens ongestoorde sessies toen muizen leerden lopen op de bovenste sporten (H-H-treden) en de lagere te vermijden als een efficiënter patroon om de ladder over te steken (R = 0,90, ***p < 0,0001, Figuur 2C).

Van dag 5 tot 8 werden de muizen onderworpen aan uitdagingssessies waarbij een onverwacht obstakel (US) werd geïntroduceerd (één sport wordt willekeurig 18 mm boven het stapoppervlak verhoogd). In sommige proeven wordt een toon (CS, 90 dB, 15 kHz toon van 250 ms) 250 ms voor de Amerikaanse verstoring gepresenteerd (zie figuur 1B).

Met het begin van de uitdagingssessies op dag 5 hadden dieren meer tijd nodig om de ladder over te steken tijdens proeven die alleen in de VS waren uitgevoerd vanwege de onvoorziene introductie van het obstakel (dag 4: 5,01 s; Figuur 2B; Dag 5: 7.84 s; Figuur 3; Gepaarde t-toets,*p < 0,039). De muisprestaties verbeterden van dag 5 tot 8, wat een aanzienlijke leercurve opleverde voor sessies die alleen in de VS werden gehouden (R = 0,50, *p = 0,045, Figuur 3, oranje). In associatieve leerproeven, waarbij het obstakel gepaard ging met een toon, voltooiden de dieren de dagelijkse sessies significant sneller in vergelijking met onderzoeken die alleen in de VS werden uitgevoerd (R = 0,63, figuur 3, paars; RM ANOVA in twee richtingen, *p = 0,028). Ten slotte werd in controleonderzoeken waarbij de toon alleen werd gepresenteerd (alleen CS), een significante leercurve gerapporteerd die leek op ongestoorde sessies (R = 0,82, ***p < 0,001, figuur 3, blauw).

Analyse van de stappatronen zorgde voor extra bevestiging en verhoogde gevoeligheid bij het detecteren van verschillen tussen alleen in de VS en associatieve onderzoeken. Figuur 4A laat zien hoe het percentage onderzoeken met misstappen constant bleef tijdens onderzoeken die alleen in de VS werden uitgevoerd (R = 0,01, p = 0,90, oranje), terwijl een significante afname van onderzoeken met misstappen werd waargenomen tijdens gepaarde sessies (R = 0,61, *p = 0,01, paars). Figuur 4B toont een significant verschil tussen de staptijden voor en na de verstoring in onderzoeken die alleen in de VS zijn uitgevoerd (RM ANOVA in twee richtingen, *p = 0,05), maar niet in gepaarde onderzoeken waarbij muizen sneller leerden om het obstakel te overwinnen. Alle bestudeerde variabelen en de toegepaste statistische tests zijn opgenomen in aanvullende tabel S1.

Figuur 1: Systeem, protocol en parameters. (A) De Erasmusladder bestaat uit een horizontale ladder geflankeerd door twee doeldozen. De cartoon vertegenwoordigt de ladder met afwisselend hoge en lage sporten en de belangrijkste geregistreerde parameters, inclusief staptypes (normale stappen, gevulde lijn; of misstappen, stippellijn) en pre- en post-perturbatiestaptijd gedefinieerd als de tijd die de muis nodig heeft om een obstakel (ongeconditioneerde stimulus; hogere sport) te overwinnen dat al dan niet wordt aangekondigd door een toon (geconditioneerde stimulus). (B) Het protocol bestaat uit vier ongestoorde en vier challenge-sessies (één sessie/dag, 42 proeven/sessie) die het mogelijk maken om fijn motorisch leren (ongestoord en alleen CS in blauw), uitgedaagd motorisch leren (alleen VS, in oranje) en associatief motorisch leren (gepaarde CS + VS, in paars) afzonderlijk te analyseren. Afkortingen: H = hoog; L = laag; CS = geconditioneerde stimulus; VS = onvoorwaardelijke stimulans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Motorische prestaties van WT-muizen tijdens ongestoorde sessies. (A) Rusttijd in het doelgebied (constant, 15 s), tijd om te reageren op signalen: licht (constant, 3 s) en lucht (variabel); gedurende dagen 1-4 van ongestoorde sessies. (B) Tijd om de ladder over te steken na cue (licht en lucht) tijdens ongestoorde sessies. (C) Percentage proeven in elke ongestoorde sessie waarbij het dier een stap heeft overgeslagen. Een vermogensregressieanalyse werd gebruikt om de leervoortgang te bestuderen (R= 0,50: *p = 0,047, R= 0,90 ***p < 0,0001, respectievelijk, n = 4 muizen). Afkorting: WT = wildtype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Prestaties van WT-muizen tijdens challenge-sessies. Gemiddelde tijd op de ladder na cues gedurende dag 5-8 voor alleen VS (oranje), gepaarde (paars) en CS-only (lichtblauw) proeven. Een power non-lineaire regressieanalyse werd gebruikt om de leervoortgang te bestuderen (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n=4 muizen). Tweerichtings-RM ANOVA om proeftypes te vergelijken (*p = 0,028, **p = 0,008, n=4 muizen, twee mannetjes en twee vrouwtjes, gemiddelde ± SEM). Afkortingen: CS = geconditioneerde stimulus; VS = onvoorwaardelijke stimulans. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Veranderingen in muisstappatronen tijdens challenge-sessies. (A) Percentage proeven per sessie waarbij het dier een stap miste tijdens sessies die alleen in de VS en in paren werden uitgevoerd. Een vermogensregressieanalyse werd gebruikt om het leerproces te bestuderen (*p = 0,013) en een tweerichtings-RM ANOVA voor vergelijking tussen proeftypes (*p = 0,032, n = 4 muizen). (B) Pre- en post-perturbatiestaptijd(en) in alleen VS-sessies en gepaarde sessies tijdens de sessies. Herhaalde metingen in twee richtingen ANOVA, *p < 0,05, n = 4 muizen, twee mannetjes en twee vrouwtjes, gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Software-interface: hoe maak je een experiment en selecteer je een protocol. Schermafbeeldingen van de software ter illustratie van de workflow die wordt beschreven in protocolstap 2.1, met betrekking tot de stappen 2.1.4 tot en met 2.1.8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding S2: Software-interface: hoe de sessie te starten en de gegevens te exporteren. Schermafbeeldingen van de software ter illustratie van de workflow die wordt beschreven in protocolstappen 2.2 en 2.5, met betrekking tot de stappen 2.2.4 tot en met 2.2.7 en 2.5.1 tot en met 2.5.3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Statistische tabel. Beschrijving van alle bestudeerde variabelen en de toegepaste statistische toetsen, weergegeven in figuur 2B,C, figuur 3 en figuur 4A,B. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De Erasmusladder biedt grote voordelen voor de beoordeling van motorische fenotypes die verder gaan dan de huidige benaderingen. Testen is eenvoudig uit te voeren, geautomatiseerd, reproduceerbaar en stelt onderzoekers in staat om verschillende aspecten van motorisch gedrag afzonderlijk te beoordelen met behulp van een enkel muiscohort. In de huidige studie maakte reproduceerbaarheid het mogelijk om robuuste gegevens te genereren met een klein aantal WT-muizen die gebruik maakten van de kenmerken van het apparaat, het experimentele ontwerp en de analysemethoden. Bijvoorbeeld, in vergelijking met traditionele beam-walk-assays, verhoogt de toevoeging van motiverende signalen (lucht en licht) om het ladderpad te betreden en de rugwind om de proef te voltooien de consistentie en slaat de noodzaak van interventie van de onderzoeker over, wat een belangrijke bron van variabiliteit is.

Een luchtcompressorsysteem is nodig om een luchtstroom te genereren die kan worden aangepast aan de richting en positie van de muis. De luchtstroom creëert een tegenwind van 30 km/u uit de tegenovergestelde richting wanneer een muis probeert het doelvak te verlaten voordat de geplande proefstart begint, waardoor de muizen terugkeren naar het doelvak. Het genereert ook een constante rugwind (1 tot 16 km/u) tijdens de proef totdat de muis de ladder volledig overschrijdt en het tegenoverliggende doelvak binnengaat. Zonder de perslucht als stimulans om de ladder over te steken, pauzeren muizen vaak op de sporten en keren ze in een rustig tempo van richting, wat een verkennende variabele introduceert die contraproductief is voor de analyse.

Het hier beschreven standaardprotocol biedt metingen van de basiscoördinatie en het leren van de fijne motoriek (ongestoorde sessies), evenals van de aanpassing aan uitdagingen en associatief motorisch leren (uitdagingssessies) over een tijdspanne van 8 dagen. De taak is gemakkelijk voor WT-muizenstammen die doorgaans worden gebruikt voor neurowetenschappelijke studies, zoals de C57Bl6J-muizen die hier worden gebruikt, en is veilig, zonder dat er verwondingen zijn waargenomen in een van de testsessies. Bovendien hebben we geen tekenen van vermoeidheid gedetecteerd in vergelijking met andere motortests zoals de rotarod of loopband.

Gedurende de beginfase van 4 dagen beheersen WT-muizen de vaardigheid en steken ze de ladder over door te leren het meest efficiënte looppatroon aan te nemen (H-H-stappen) en misstappen komen zelden voor op dag 4 (Figuur 2B,C). Op dag 5 van de tweede fase zijn muizen langzamer wanneer ze het obstakel voor het eerst tegenkomen, maar passen ze zich snel aan (Figuur 3, alleen in de VS). Het koppelen van het obstakel aan een conditionerende stimulus (toon) vergemakkelijkt het leren in die mate dat de duur van de proef gelijk is aan proeven waarbij het obstakel niet wordt gepresenteerd (Figuur 3, gekoppeld). Merk op dat het aantal onderzoeken met misstappen constant bleef tijdens onderzoeken die alleen in de VS werden uitgevoerd (Figuur 4A), terwijl een significante afname werd waargenomen in gepaarde sessies (Figuur 4A), wat de effectiviteit van het associatieve leerproces bevestigt.

We stellen een workflow voor voor de analyse van representatieve parameters die door de software van de Erasmus Ladder worden geleverd. De vermogensregressieanalyse stelde ons in staat om significante leercurves te registreren en verschillen in uitgedaagd versus associatief leren te detecteren met behulp van vier WT-muizen. Op basis van aanvullende literatuur en proefexperimenten kan het bij experimentele ontwerpen met gemuteerde of behandelde muizen nodig zijn om het aantal muizen te verhogen tot 7-10 muizen ^4,5,6. In onze handen was 42 onderzoeken per sessie een optimaal aantal om robuuste gegevens te verkrijgen met een klein muizencohort, omdat het gemiddelde van meerdere onderzoeken de variabiliteit vermindert. Hoewel het aantal misschien hoog lijkt, duurt elke 42 proefsessie tussen de 15 minuten en 35 minuten, en 12-16 muizen kunnen redelijk per dag worden getest. De duur van de proef (inclusief de rusttijd en reactie op signalen plus de tijd om de ladder te overbruggen) varieert tussen 20 s en 50s, afhankelijk van de trainingsdag en het type proef.

Desalniettemin zal de veelzijdigheid van het systeem onderzoekers in staat stellen om aangepaste protocollen te ontwerpen door verschillende instellingen aan te passen, waaronder het aantal sessies en proeven per dag, de intensiteit en duur van cues en CS, evenals de aard van de VS. Onze gegevens toonden bijvoorbeeld een snelle leercurve bij WT-muizen, met name tussen dag 1 en dag 2 nadat de prestaties een plateau hebben bereikt (figuren 2B,C). Dit suggereerde dat de extra 2 dagen misschien niet strikt noodzakelijk zijn voor het testen van basismotorisch leren in ongestoorde sessies, en dat wijzigingen in het standaardprotocol kunnen worden doorgevoerd door de trainingsduur te verkorten tot slechts 2 dagen. Toch is deze aanpassing mogelijk niet geschikt voor de tweede fase van het protocol, die interleaved ongestoorde, alleen VS, alleen CS en gepaarde proeven omvat. De stimuli worden willekeurig en onverwacht gepresenteerd om specifiek gedrag te beoordelen, en de noodzaak om experimentele onderzoeken in deze vier categorieën te verdelen, maakt 42 een geschikt aantal onderzoeken dat nodig is voor statistische kracht. Bij een reorganisatie van het protocol zou dus de haalbaarheid moeten worden beoordeeld van het verminderen van het aantal ongestoorde proeven of het verhogen van specifieke uitdagingsproeven. Het interstimulusinterval (ISI) tussen CS (90 dB, 15 kHz toon) en US, hier ingesteld op 250 ms, kan ook worden gevarieerd om de stimulus-responsassociatie te bestuderen. Dit soort aanpassingen zou onderzoekers in staat stellen de moeilijkheidsgraad te titreren of zich te concentreren op verschillende gedragingen volgens de wetenschappelijke vraag.

Tot op heden wordt de Erasmusladder vooral gebruikt om subtiele defecten in de motorische coördinatie van cerebellaire oorsprong op te sporen. Misstappen zijn bijvoorbeeld een maat voor de locomotorische coördinatie van het hele lichaam. In deze studie werden jongvolwassen muizen gebruikt, maar muizen zo jong als P23 zijn door anderen gebruikt om de rijping van bewegingsfuncties te bestuderen ^7,8. Ipsilaterale pathologieën van centrale oorsprong kunnen worden bestudeerd door middel van discriminerende analyse van de positie van de rechter- en linkerpoot van de muis. Ten slotte activeert het beheersen van motorische vaardigheden in de Erasmus-ladder waarschijnlijk andere motorische controlecircuits, waarbij de basale ganglia, motorische cortex en verbindingspaden, waaronder het corpus callosum, betrokken zijn. Het combineren van dit gedragsparadigma met cellulaire, moleculaire en circuittechnieken zal nuttig zijn om circuitmechanismen te onderzoeken die motorische aanpassing mediëren en kunnen worden gebruikt om motorisch leren te stimuleren. Een voorbeeld hiervan is het bestuderen van de invloed op axonale myelinisatie, die zeer gevoelig is voor het verwerven van fijne motoriek in muismodellen van demyelinisatie ^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.