Overvågning af fin- og associativ motorisk indlæring hos mus ved hjælp af Erasmus-stigen

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol, der tillader en ikke-invasiv og automatiseret vurdering af finmotorisk ydeevne samt adaptiv og associativ motorisk læring ved hjælp af en enhed kaldet Erasmus Ladder. Opgavevanskeligheder kan titreres for at detektere motorisk svækkelse, der spænder fra større til subtile grader.

Abstract

Adfærd formes af handlinger, og handlinger kræver motoriske færdigheder som styrke, koordination og læring. Ingen af de adfærdsmønstre, der er afgørende for at opretholde livet, ville være mulige uden evnen til at skifte fra en position til en anden. Desværre kan motoriske færdigheder blive kompromitteret i en lang række sygdomme. Derfor er det afgørende at undersøge mekanismerne for motoriske funktioner på celle-, molekylær- og kredsløbsniveau samt forstå symptomer, årsager og progression af motoriske lidelser for at udvikle effektive behandlinger. Musemodeller anvendes ofte til dette formål.

Denne artikel beskriver en protokol, der tillader overvågning af forskellige aspekter af motorisk ydeevne og læring hos mus ved hjælp af et automatiseret værktøj kaldet Erasmus Ladder. Analysen involverer to faser: en indledende fase, hvor mus trænes til at navigere i en vandret stige bygget af uregelmæssige trin ("finmotorisk læring"), og en anden fase, hvor en hindring præsenteres i det bevægelige dyrs vej. Forstyrrelsen kan være uventet ("udfordret motorisk læring") eller forud for en auditiv tone ("associativ motorisk læring"). Opgaven er let at udføre og understøttes fuldt ud af automatiseret software.

Denne rapport viser, hvordan forskellige aflæsninger fra testen, når de analyseres med følsomme statistiske metoder, muliggør fin overvågning af musemotoriske færdigheder ved hjælp af en lille kohorte af mus. Vi foreslår, at metoden vil være meget følsom til at evaluere motoriske tilpasninger drevet af miljøændringer samt tidlige stadier af subtile motoriske underskud hos mutante mus med kompromitterede motoriske funktioner.

Introduction

En række tests er blevet udviklet til at vurdere motoriske fænotyper hos mus. Hver test giver information om et specifikt aspekt af motorisk adfærd¹. For eksempel informerer den åbne felttest om generel bevægelse og angsttilstand; rotarod- og gangstråleprøver på koordination og balance fodaftryksanalyse handler om gang; løbebånd eller løbehjul ved tvungen eller frivillig fysisk træning Og det komplekse hjul handler om motorisk indlæring. For at analysere musemotoriske fænotyper skal efterforskere udføre disse tests sekventielt, hvilket involverer meget tid og kræfter og ofte flere dyrekohorter. Hvis der er information på mobil- eller kredsløbsniveau, vælger efterforskeren normalt en test, der overvåger et beslægtet aspekt og følger derfra. Imidlertid mangler paradigmer, der diskriminerer forskellige aspekter af motorisk adfærd på en automatiseret måde.

Denne artikel beskriver en protokol til brug af Erasmus Ladder ^2,3, et system, der muliggør omfattende vurdering af en række motoriske indlæringsfunktioner hos mus. De vigtigste fordele er metodens reproducerbarhed og følsomhed sammen med evnen til at titrere motoriske vanskeligheder og adskille underskud i motorisk ydeevne fra nedsat associativ motorisk læring. Hovedkomponenten består af en vandret stige med alternative høje (H) og lave (L) trin udstyret med berøringsfølsomme sensorer, der registrerer musens position på stigen. Stigen er lavet af 2 x 37 trin (L, 6 mm; H, 12 mm) med en indbyrdes afstand på 15 mm og placeret i et venstre-højre skiftemønster med 30 mm mellemrum (figur 1A). Rungs kan flyttes individuelt for at generere forskellige sværhedsgrader, det vil sige at skabe en hindring (hæve de høje trin med 18 mm). Sammen med et automatiseret registreringssystem og sammenkædning af ændringer af trinmønsteret med sensoriske stimuli tester Erasmus-stigen finmotorisk indlæring og tilpasning af motorisk ydeevne som reaktion på miljømæssige udfordringer (udseende af et højere trin for at simulere en forhindring, en ubetinget stimulus [US]) eller tilknytning til sensoriske stimuli (en tone, en betinget stimulus [CS]). Testen involverer to forskellige faser, der hver vurderer forbedring i motorisk ydeevne over 4 dage, hvor mus gennemgår en session på 42 på hinanden følgende forsøg om dagen. I den indledende fase trænes mus til at navigere på stigen for at vurdere "fin" eller "dygtig" motorisk læring. Den anden fase består af sammenflettede forsøg, hvor en hindring i form af et højere trin præsenteres i det bevægelige dyrs vej. Forstyrrelsen kan være uventet for at vurdere "udfordret" motorisk læring (kun USA-forsøg) eller annonceret af en auditiv tone for at vurdere "associativ" motorisk læring (parrede forsøg).

Erasmus-stigen er blevet udviklet relativt for nylig ^2,3. Det er ikke blevet brugt i vid udstrækning, fordi opsætning og optimering af protokollen krævede fokuseret indsats og var specielt designet til at vurdere cerebellarafhængig associativ læring uden at udforske detaljeret dets potentiale til at afsløre andre motoriske underskud. Til dato er det blevet valideret for dets evne til at afsløre subtile motoriske svækkelser forbundet med cerebellær dysfunktion hos mus 3,4,5,6,7,8. For eksempel viser connexin36 (Cx36) knockout-mus, hvor mellemrumskryds er nedsat i olivary neuroner, affyringsunderskud på grund af manglende elektrotonisk kobling, men motorfænotypen havde været svært at lokalisere. Test ved hjælp af Erasmus-stigen antydede, at rollen som ringere olivary neuroner i en cerebellar motorisk læringsopgave er at kode præcis tidsmæssig kodning af stimuli og lette læringsafhængige reaktioner på uventede begivenheder ^3,4. Fragil X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1) knockout mus, en model for Fragile-X-syndrom (FXS), udviser en velkendt kognitiv svækkelse sammen med mildere defekter i proceduremæssig hukommelsesdannelse. Fmr1 knockouts viste ingen signifikante forskelle i skridttider, fejltrin pr. forsøg eller motorisk præstationsforbedring i forhold til sessioner i Erasmus Ladder, men undlod at justere deres gangmønster til den pludselig fremkomne hindring sammenlignet med deres wild-type (WT) kuldkammerater, hvilket bekræfter specifikke proceduremæssige og associative hukommelsesunderskud ^3,5. Desuden udviste cellespecifikke musemutantlinjer med defekter i cerebellar funktion, herunder nedsat Purkinje-celleoutput, potensering og molekylære laginterneuron- eller granulatcelleudgange, problemer i motorisk koordinering med ændret erhvervelse af effektive trinmønstre og i antallet af trin, der blev taget for at krydse stigen⁶. Neonatal hjerneskade forårsager cerebellære indlæringsunderskud og Purkinje-celledysfunktion, der også kunne påvises med Erasmus-stigen ^7,8.

I denne video præsenterer vi en omfattende trin-for-trin guide, der beskriver opsætningen af adfærdsrummet, adfærdstestprotokollen og efterfølgende dataanalyse. Denne rapport er udformet til at være tilgængelig og brugervenlig og er designet specielt til at hjælpe nytilkomne. Denne protokol giver indsigt i forskellige faser af motorisk træning og forventede motoriske mønstre, som mus vedtager. Endelig foreslår artiklen en systematisk arbejdsgang til dataanalyse ved hjælp af en kraftfuld ikke-lineær regressionstilgang, komplet med værdifulde anbefalinger og forslag til tilpasning og anvendelse af protokollen i andre forskningssammenhænge.

Protocol

I den aktuelle undersøgelse blev voksne (2-3 måneder gamle) C57BL/6J-mus af begge køn anvendt. Dyrene blev anbragt to til fem pr. bur med ad libitum adgang til mad og vand i en dyreenhed under observation og opretholdt i et temperaturkontrolleret miljø i en 12 timers mørk/lys cyklus. Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med de europæiske og spanske forordninger (2010/63/EU; RD 53/2013) og blev godkendt af det etiske udvalg ved Generalitat Valenciana og dyrevelfærdsudvalget ved Universidad Miguel Hernández.

1. Opsætning af adfærdsrum

1. Reserver adfærdstestrummet hver dag på samme tid, og opret listen og rækkefølgen af mus, der skal bruges, samt arrangementer for deres hosting.
2. Hold forsøgsmusene uden for testrummet, så de ikke hører lyden af luftkompressoren og Erasmus Ladder-tonerne, når de ikke testes.
3. Kontroller, at alle komponenter i Erasmus Ladder-systemet er i orden og klar til brug: netværksrouteren, computeren med softwaren (se materialetabellen), luftkompressoren, to målbokse og stigen med trinene korrekt placeret.
4. Rengør målbokse, stige og trin grundigt med vand efter hvert dyr og med vand og 70% ethanol ved afslutningen af hver træningsdag.

2. Protokol for adfærdstest

1. Opret et eksperiment, og indtast protokollen i softwaren (supplerende figur S1).
   1. Tænd softwaren.
   2. Hvis du vil oprette et eksperiment, skal du vælge Filer | Nyt eksperiment | Ny eller Opsætning | Eksperiment protokol.
      BEMÆRK: Standardprotokollen, der bruges i denne undersøgelse, hedder EMC og blev designet på Erasmus University Medical Center, Rotterdam.
   3. Giv eksperimentet et navn, og klik på OK.
   4. Kontroller, at den valgte EMC-standardprotokol består af 4 dages uforstyrrede sessioner (42 uforstyrrede forsøg pr. dag) og 4 dages udfordringssessioner (42 daglige blandede forsøg: uforstyrret, kun CS (tone), kun USA (forhindring), parret (forhindring annonceret af tone) (se figur 1B). I højre sidepanel skal du også kontrollere lyssignalet (3 s maksimal varighed), luftsignal (45 s maksimal varighed) og medvind (Ja i alle forsøgstyper), der bruges til at tilskynde musen til at krydse stigen, og tonen (250 ms, Ja kun i CS-only og parrede forsøg).
   5. Hvis du vil oprette en anden protokol, skal du vælge Konfigurer | Eksperimentprotokol | Ny | Fra bunden eller Kopier fra EMC-protokollen og blot ændre den, redigere tabellinjerne relateret til antal sessioner (eksperimentdage) og antal og type forsøg pr. Dag.
      BEMÆRK: Hviletid, signaltype og aktivering, varighed, intensitet og interval kan også tilpasses i henhold til de eksperimentelle spørgsmål.
   6. Hvis du vil åbne sessionslisten og navngive emnerne, skal du vælge Opsætning | Sessionsliste.
   7. Klik på Tilføj emner og variabler.
   8. Indtast hver specifik museidentifikator, fødselsdato, køn, genotype og relevante kategorier efter den ordnede liste over mus.
2. Start sessionen (supplerende figur S2).
   1. Før du starter, skal du kontrollere, at softwaren er åben, og derefter tænde stigen.
   2. Kontroller, at luftkompressoren er tilsluttet og tændt.
   3. Hvis du vil åbne vinduet Anskaffelse, skal du åbne det oprettede eksperiment.
   4. Vælg anskaffelse | Åben anskaffelse.
   5. Placer musen med den identifikator, der er angivet af softwaren, i startmålboksen (højre side af stigen).
   6. Vælg det muse-id , der skal hentes i den første session.
   7. Klik på Start erhvervelse.
   8. Tryk på den røde stigemenuknap 3x. Kontroller, at sessionen starter og automatisk styrer og registrerer musebevægelser indtil slutningen af den sidste prøveversion af sessionen.
3. Afslut sessionen.
   1. Kontroller, at displayet i slutningen af den 42^. prøveperiode viser meddelelserne Afsendelse af data og erhvervet.
   2. Sæt musen tilbage i hjemmeburet.
   3. Rengør stigen og målboksene.
   4. Placer den næste mus, og gentag fra trin 2.2.6 og fremefter.
4. Udfør den valgte type session hver dag indtil slutningen af protokollen. Gentag trin 2.2 og 2.3 hver dag i henhold til den valgte protokol.
5. Eksportér dataene (supplerende figur S2).
   1. Hvis du vil visualisere de registrerede data, skal du vælge Prøvestatistik og Gruppestatistik & diagrammer i menuen Analyse.
      BEMÆRK: Data kan downloades som et regneark med data for individuelle forsøg og midlerne til de samme forsøgstyper inden for en session. Sessioner kan også filtreres efter variabler valgt til specifik analyse.
   2. Klik på eksport knappen øverst til højre ved at vælge filformat (regneark) og mappeplacering.
   3. Højreklik på de automatisk genererede diagrammer, og vælg Gem i fil som *.jpg.

3. Analyse af data

BEMÆRK: En liste over parametre måles automatisk af Erasmusstigen baseret på øjeblikkelig registrering af de berøringsfølsomme sensorers aktiviteter. Til analyse organiseres og behandles outputparametre valgt af brugeren i regnearkene. Sammen med de softwaregenererede grafer kan brugerne generere grafer ved hjælp af den valgte grafsoftware til at visualisere specifikke ændringer i forskellige parametre over sessioner.

1. Vælg specifikke parametre for at analysere basal motivation eller angsttilstande, sensoriske reaktioner, motorisk ydeevne og finmotorisk læring i løbet af de første 4 dage.
   1. Vælg og plot kontrolparametre, herunder hviletid i målboksen og tid til at forlade målboksen efter hvileperioden som reaktion på lys- og luftsignaler (figur 2A).
      BEMÆRK: Hviletider eller respons på signaler er relativt konstante hos WT-mus. Andre parametre såsom hyppigheden af udgange er stort set ubetydelige i WT-mus - dyrene forlader sjældent hvileboksen uden signaler eller kommer tilbage en gang i stigen, hvilket resulterer i udgangsfrekvenser svarende til 1 pr. Forsøg. Hvis et dyr går ud, før signaler anvendes, aktiveres en luftstrøm, der tvinger musen til at vende tilbage til målboksen; Dette tælles ikke som en prøveversion af softwaren.
   2. Vælg og plot tiden på stige efter stikord, målt som den tid, der bruges på at krydse stigen, når musen forlader målboksen (figur 2B).
      BEMÆRK: En effekt ikke-lineær regression er en robust metode til evaluering af læring. Pearson- eller Spearman-koefficienterne (R) giver et mål for, om datatilpasningen er god (R-værdier tæt på en, når dyrene lærer/forbedrer sig over sessioner; R-værdier tæt på 0 indebærer, at dataene er konstante, og mus lærer ikke).
   3. Vælg og afbild trinmønsterparametre , f.eks. procentdelen af forsøg med fejltrin som en følsom indlæringsparameter (figur 2C).
      1. Definer et korrekt trin som et trin fra et højt trin til et andet højt trin (H-H), uanset trinets længde. Overvej trintyper, der involverer et lavere trin, som fejltrin.
      2. Opdel korrekte trin og fejltrin i korte og lange trin, tilbageskridt og spring afhængigt af længden og retningen af trinnet mellem de pressede trin (se figur 1A).
2. Vælg og plot specifikke parametre for at evaluere udfordret motorisk læring (kun USA-forsøg) og associativ læring (parrede forsøg) i løbet af de sidste 4 dage.
   1. Vælg og plot tiden på stigen efter køindikatorer (figur 3).
   2. Vælg og plot procentdelen af forsøg med fejltrin (figur 4A).
   3. Vælg og plot trintiderne før og efter forstyrrelse, defineret som en ms præcisionsforskel mellem trinaktivering lige før (kontroltrin) og efter forhindringen (tilpasset trin) på samme side af stigen (figur 4B).
      BEMÆRK: Analyse før vs efter forstyrrelse skal udføres for at sammenligne data inden for hver type session. Parameteren måler musenes evne til at forudsige og overvinde forhindringerne under associativ læring.
3. Analysér dataene med dedikeret statistisk software (f.eks. SigmaPlot). Udfør en ikke-lineær regressionsanalyse af data indsamlet fra den samme forsøgstype på tværs af sessioner for at beskrive læringsprocessen mere effektivt, og brug RM ANOVA (Two-Way Repeated Measures) til at sammenligne mellem forsøgstyper.

Representative Results

Erasmus Ladder-enheden, opsætningen og den anvendte protokol er vist i figur 1. Protokollen består af fire uforstyrrede og fire udfordringssessioner (42 forsøg hver). Hvert forsøg er et løb på stigen mellem start- og slutmålfelterne. I begyndelsen af sessionen placeres en mus i en af startboksene. Efter en indstillet tid på 15 ± 5 s ("hvilende" tilstand) tændes lyset (cue 1, i maksimalt 3 s). En let luftsignal (cue 2, maksimalt 45 s) påføres derefter for at tilskynde musene til at forlade kassen og gå til den modsatte ende. Tiden til at reagere på luftsignalet kan variere mellem mus og sessioner og kan bruges som parameter til at sammenligne motivations- eller angsttilstande mellem grupper. En ny prøveversion startes straks, når musen når slutmålboksen.

Der blev ikke observeret forskelle i hviletid og tid til at reagere på lyssignalet hos WT-mus på dag 1-4, men tiden til at reagere på luftsignalet faldt lidt mellem dag 1 og 2 (figur 2A). Målinger af tiden til at krydse stigen gav en signifikant indlæringskurve fra dag 1 til 4, der kunne udstyres med en effektregressionskurve (R = 0,50, *p = 0,047, figur 2B). En nøgleparameter, der bestemmer den tid, det tager at krydse stigen, er forekomsten af fejltrin. I takt med forkortelsen af tiderne på stigen faldt antallet af forsøg, hvor mus lavede fejltrin, i løbet af uforstyrrede sessioner, da mus lærte at gå på de øverste trin (H-H-trin) og undgå de nederste som et mere effektivt mønster til at krydse stigen (R = 0,90, ***p < 0,0001, figur 2C).

Fra dag 5 til 8 blev musene udsat for udfordringssessioner, hvor en uventet forhindring (US) blev introduceret (et trin hæves tilfældigt med 18 mm over trinfladen). I nogle forsøg præsenteres en tone (CS, 90 dB, 15 kHz tone, der varer 250 ms) 250 ms før den amerikanske forstyrrelse (se figur 1B).

Med begyndelsen af udfordringssessioner på dag 5 krævede dyrene mere tid til at krydse stigen under forsøg, der kun var i USA, på grund af den uforudsete introduktion af forhindringen (dag 4: 5.01 s; Figur 2B; dag 5: 7,84 s; Figur 3; parret t-test, * p < 0,039). Musens ydeevne blev forbedret fra dag 5 til 8, hvilket gav en betydelig indlæringskurve på tværs af sessioner, der kun var i USA (R = 0,50, *p = 0,045, figur 3, orange). I associative læringsforsøg, hvor hindringen blev parret med en tone, gennemførte dyrene de daglige sessioner betydeligt hurtigere i forhold til kun amerikanske forsøg (R = 0,63, figur 3, lilla; tovejs RM ANOVA, *p = 0,028). Endelig blev der i kontrolforsøg, hvor tonen blev præsenteret alene (kun CS), rapporteret en signifikant indlæringskurve, der lignede uforstyrrede sessioner (R = 0,82, ***p < 0,001, figur 3, blå).

Analyse af trinmønstrene gav yderligere bekræftelse og øget følsomhed ved påvisning af forskelle mellem kun amerikanske og associative forsøg. Figur 4A viser, hvordan procentdelen af forsøg med fejltrin forblev konstant gennem kun amerikanske forsøg (R = 0,01, p = 0,90, orange), mens der blev observeret et signifikant fald i forsøg med fejltrin under parrede sessioner (R = 0,61, *p = 0,01, lilla). Figur 4B viser en signifikant forskel mellem trintider før og efter forstyrrelse i forsøg, der kun er i USA (tovejs RM ANOVA, *p = 0,05), men ikke i parrede forsøg, hvor mus lærte hurtigere at overvinde forhindringen. Alle de undersøgte variabler og de anvendte statistiske test er angivet i supplerende tabel S1.

Figur 1: System, protokol og parametre. (A) Erasmus-stigen består af en vandret stige flankeret af to målbokse. Tegneserien repræsenterer stigen med skiftevis høje og lave trin og de vigtigste registrerede parametre, herunder trintyper (normale trin, udfyldt linje eller fejltrin, stiplet linje) og trintid før og efter forstyrrelse defineret som den tid, musen har brug for for at overvinde en hindring (ubetinget stimulus; højere trin) annonceret eller ej af en tone (betinget stimulus). (B) Protokollen består af fire uforstyrrede og fire udfordringssessioner (en session / dag, 42 forsøg / session), der giver mulighed for separat analyse af finmotorisk læring (uforstyrret og kun CS i blå), udfordret motorisk læring (kun USA, i orange) og associativ motorisk læring (parret CS + US, i lilla). Forkortelser: H = høj; L = lav; CS = betinget stimulus; US = ubetinget stimulus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: WT-mus' motoriske ydeevne under uforstyrrede sessioner. (A) Hviletid i målboksen (konstant, 15 s), tid til at reagere på signaler: lys (konstant, 3 s) og luft (variabel); over dag 1-4 af uforstyrrede sessioner. (B) Tid til at krydse stigen efter cue (lys og luft) under uforstyrrede sessioner. C) Procentdel forsøg i hver uforstyrret session, hvor dyret ikke nåede et trin. En effektregressionsanalyse blev brugt til at studere læringsforløbet (R = 0,50: *p = 0,047, R = 0,90 ***p < 0,0001, henholdsvis n = 4 mus). Forkortelse: WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: WT-mus' ydeevne under udfordringssessioner. Gennemsnitlig tid på stigen efter køindikatorer i dag 5-8 for forsøg, der kun er i USA (orange), parret (lilla) og kun CS (lyseblå). En effekt ikke-lineær regressionsanalyse blev brugt til at studere læringsforløbet (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n = 4 mus). Tovejs RM ANOVA til sammenligning af forsøgstyper (*p = 0,028, **p = 0,008, n = 4 mus, to hanner og to hunner, gennemsnit ± SEM). Forkortelser: CS = betinget stimulus; US = ubetinget stimulus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Ændringer i musetrinmønstre i forhold til udfordringssessioner. (A) Procentdel af forsøg pr. session, hvor dyret gik glip af et trin under kun amerikanske og parrede sessioner. En effektregressionsanalyse blev brugt til at studere læringsprocessen (*p = 0,013) og en tovejs RM ANOVA til sammenligning mellem forsøgstyper (*p = 0,032, n = 4 mus). (B) Før og efter forstyrrelse trintid (er) kun i USA og parrede sessioner under hele sessionerne. Tovejs gentagne målinger ANOVA, *p < 0,05, n = 4 mus, to hanner og to hunner, betyder ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Softwaregrænseflade: hvordan man opretter et eksperiment og vælger en protokol. Skærmbilleder fra softwaren, der illustrerer arbejdsgangen beskrevet i protokoltrin 2.1, der dækker trin 2.1.4 til 2.1.8. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Softwaregrænseflade: hvordan man starter sessionen og eksporterer dataene. Skærmbilleder fra softwaren, der illustrerer arbejdsgangen beskrevet i protokoltrin 2.2 og 2.5, der dækker trin 2.2.4 til 2.2.7 og 2.5.1 til 2.5.3. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Statistisk tabel. Beskrivelse af alle de undersøgte variabler og de anvendte statistiske test, jf. figur 2B,C, figur 3 og figur 4A,B. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Erasmus-stigen giver store fordele for vurdering af motorisk fænotype ud over de nuværende tilgange. Testning er let at udføre, automatiseret, reproducerbar og giver forskere mulighed for at vurdere forskellige aspekter af motorisk adfærd separat ved hjælp af en enkelt musekohorte. I den aktuelle undersøgelse tillod reproducerbarhed generering af robuste data med et lille antal WT-mus, der udnyttede enhedens funktioner, eksperimentelt design og analysemetoder. For eksempel, sammenlignet med traditionelle strålegangsanalyser, øger tilføjelsen af motiverende signaler (luft og lys) for at komme ind i stigebanen og medvinden for at fuldføre forsøget konsistensen og springer over behovet for eksperimentintervention, som er en vigtig kilde til variabilitet.

Et luftkompressorsystem er nødvendigt for at generere en luftstrøm, der kan justeres til musens retning og position. Luftstrømmen skaber en 30 km/t modvind fra den modsatte retning, når en mus forsøger at forlade målboksen før den planlagte forsøgsstart, hvilket får musene til at vende tilbage til målboksen. Det genererer også en konstant medvind (1 til 16 km/t) under forsøget, indtil musen krydser stigen helt og kommer ind i den modsatte målboks. Uden trykluften som incitament til at krydse stigen, standser mus ofte på trinene og vender tilbage i et roligt tempo, hvilket introducerer en udforskende variabel, der er kontraproduktiv for analysen.

Standardprotokollen beskrevet her giver målinger af grundlæggende finmotorisk koordination og læring (uforstyrrede sessioner) samt tilpasning til udfordringer og associativ motorisk læring (udfordringssessioner) over et tidsrum på 8 dage. Opgaven er let for WT-musestammer, der typisk bruges til neurovidenskabelige undersøgelser som C57Bl6J-musene, der bruges her, og er sikker uden skader observeret i nogen af testsessionerne. Derudover registrerede vi ikke tegn på træthed sammenlignet med andre motoriske tests såsom rotarod eller løbebånd.

I løbet af den indledende fase på 4 dage mestrer WT-mus færdigheden og krydser stigen ved at lære at vedtage det mest effektive løbemønster (H-H-trin), og fejltrin forekommer sjældent på dag 4 (figur 2B, C). På dag 5 i anden fase er mus langsommere, når de først støder på forhindringen, men tilpasser sig hurtigt (figur 3, kun USA). Kobling af hindringen med en konditioneringsstimulus (tone) letter læring i det omfang, at forsøgsvarighed svarer til forsøg, hvor hindringen ikke præsenteres (figur 3, parret). Det skal bemærkes, at antallet af forsøg med fejltrin forblev konstant gennem forsøg, der kun var i USA (figur 4A), mens der blev observeret et signifikant fald i parrede sessioner (figur 4A), hvilket bekræftede effektiviteten af den associative læringsproces.

Vi foreslår en arbejdsgang til analyse af repræsentative parametre, der leveres af Erasmus Ladder-softwaren. Power regressionsanalysen gjorde det muligt for os at registrere betydelige indlæringskurver og opdage forskelle i udfordret versus associativ læring ved hjælp af fire WT-mus. Baseret på yderligere litteratur og pilotforsøg kan eksperimentelle designs med mutante eller behandlede mus kræve øget museantal til 7-10 mus ^4,5,6. I vores hænder var 42 forsøg pr. session et optimalt antal til at opnå robuste data med en lille musekohorte, fordi gennemsnit af flere forsøg reducerer variabiliteten. Selvom antallet kan virke højt, tager hver 42 forsøgssession mellem 15 minutter og 35 minutter, og 12-16 mus kan med rimelighed testes om dagen. Prøvens varighed (inklusive hviletid og respons på signaler plus tid til at krydse stigen) varierer mellem 20 s og 50s afhængigt af træningsdagen og typen af forsøg.

Ikke desto mindre vil systemets alsidighed give forskere mulighed for at designe tilpassede protokoller ved at justere forskellige indstillinger, herunder antallet af sessioner og forsøg om dagen, intensiteten og varigheden af signaler og CS samt USA's karakter. For eksempel viste vores data en hurtig indlæringskurve hos WT-mus, især mellem dag 1 og dag 2, efter at præstationen har nået et plateau (figur 2B, C). Dette antydede, at de ekstra 2 dage måske ikke er strengt nødvendige for at teste grundlæggende motorisk læring i uforstyrrede sessioner, og ændringer af standardprotokollen kan implementeres ved at reducere træningsvarigheden til kun 2 dage. Alligevel er denne tilpasning muligvis ikke egnet til protokollens anden fase, som inkorporerer sammenflettede uforstyrrede, kun USA, kun CS-baserede og parrede forsøg. Stimuli præsenteres tilfældigt og uventet for at vurdere specifik adfærd, og behovet for at opdele eksperimentelle forsøg i disse fire kategorier gør 42 til et passende antal forsøg, der kræves for statistisk styrke. En reorganisering af protokollen vil således skulle vurdere muligheden for at reducere antallet af uforstyrrede forsøg eller øge antallet af specifikke provokationsforsøg. Inter-stimulusintervallet (ISI) mellem CS (90 dB, 15 kHz tone) og US, her indstillet til 250 ms, kan også varieres for at studere stimulus-respons-foreningen. Denne form for justering ville give forskere mulighed for at titrere sværhedsgraden eller fokusere på forskellige adfærd i henhold til det videnskabelige spørgsmål.

Hidtil er Erasmus-stigen mest blevet brugt til at opdage subtile defekter i motorisk koordinering af cerebellær oprindelse. For eksempel er fejltrin et mål for helkrops lokomotorisk koordination. I denne undersøgelse blev unge voksne mus brugt, men mus så unge som P23 er blevet brugt af andre til at studere modningen af lokomotoriske funktioner ^7,8. Ipsilaterale patologier af central oprindelse kunne studeres gennem diskriminerende analyse af placeringen af musens højre og venstre pote. Endelig involverer mastering af motoriske færdigheder i Erasmus-stigen sandsynligvis andre motoriske styrekredsløb, der involverer de basale ganglier, motorcortex og forbindelsesveje, herunder corpus callosum. Kombination af dette adfærdsmæssige paradigme med cellulære, molekylære og kredsløbsteknikker vil være nyttigt at undersøge kredsløbsmekanismer, der formidler motorisk tilpasning og kan udnyttes til at øge motorisk læring. Et sådant eksempel ville være at studere indflydelsen på aksonal myelinisering, som er meget følsom over for erhvervelse af fine motoriske færdigheder i musemodeller af demyelinering ^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.