Summary
В этой статье представлен протокол, который позволяет проводить неинвазивную и автоматизированную оценку мелкой моторики, а также адаптивное и ассоциативное моторное обучение при выполнении задач с помощью устройства под названием Erasmus Ladder. Сложность задачи может быть титрована для выявления двигательных нарушений в диапазоне от основных до незначительных степеней.
Abstract
Поведение формируется действиями, а действия требуют двигательных навыков, таких как сила, координация и обучение. Ни одно из видов поведения, необходимых для поддержания жизни, не было бы возможным без способности переходить из одного положения в другое. К сожалению, двигательные навыки могут быть нарушены при широком спектре заболеваний. Таким образом, изучение механизмов двигательных функций на клеточном, молекулярном и цепном уровнях, а также понимание симптомов, причин и прогрессирования двигательных нарушений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Для этой цели часто используются модели мышей.
В этой статье описывается протокол, который позволяет контролировать различные аспекты двигательной производительности и обучения у мышей с помощью автоматизированного инструмента под названием Erasmus Ladder. Тест включает в себя две фазы: начальную фазу, в которой мышей обучают перемещаться по горизонтальной лестнице, построенной из неправильных ступеней («обучение мелкой моторики»), и вторую фазу, когда на пути движущегося животного появляется препятствие. Возмущение может быть неожиданным («проблемное моторное обучение») или предваряться слуховым тоном («ассоциативное моторное обучение»). Задача проста в проведении и полностью поддерживается автоматизированным программным обеспечением.
В этом отчете показано, как различные показания теста, при анализе с помощью чувствительных статистических методов, позволяют точно контролировать моторику мышей с использованием небольшой когорты мышей. Мы предполагаем, что метод будет высокочувствителен для оценки двигательных адаптаций, обусловленных изменениями окружающей среды, а также тонких моторных дефицитов на ранних стадиях у мутантных мышей с нарушенными двигательными функциями.
Introduction
Для оценки моторных фенотипов у мышей было разработано множество тестов. Каждый тест дает информацию о конкретном аспекте двигательногоповедения1. Например, тест открытого поля информирует об общей локомоции и тревожном состоянии; испытания на координацию и равновесие на вращающейся и шагающей балке; Анализ футпринта связан с походкой; беговая дорожка или беговое колесо на принудительных или произвольных физических упражнениях; А сложное колесо — это обучение моторике. Чтобы проанализировать моторные фенотипы мышей, исследователи должны проводить эти тесты последовательно, что требует много времени и усилий, а часто и нескольких когорт животных. Если есть информация на клеточном или сетевом уровне, исследователь обычно выбирает тест, который отслеживает связанный аспект и вытекает из него. Тем не менее, парадигмы, которые бы различали различные аспекты моторного поведения автоматическим способом, отсутствуют.
В этой статье описывается протокол использования Erasmus Ladder 2,3, системы, которая позволяет комплексно оценить различные особенности моторного обучения у мышей. Основными преимуществами метода являются воспроизводимость и чувствительность метода, а также способность титровать моторные трудности и отделять дефицит двигательных функций от нарушения ассоциативно-моторного обучения. Основной компонент состоит из горизонтальной лестницы с чередующимися высокими (H) и низкими (L) перекладинами, оснащенных сенсорными датчиками, которые определяют положение мыши на лестнице. Лестница изготовлена из 2 x 37 ступеней (L, 6 мм; H, 12 мм), расположенные на расстоянии 15 мм друг от друга и расположенные попеременно слева и справа с зазорами 30 мм (рис. 1А). Перекладины можно перемещать по отдельности для создания различных уровней сложности, то есть создания препятствия (поднимая высокие ступени на 18 мм). В сочетании с автоматизированной системой регистрации и ассоциацией модификаций паттерна ступеней с сенсорными стимулами, лестничные тесты Эразма для обучения мелкой моторики и адаптации двигательных функций в ответ на вызовы окружающей среды (появление более высокой ступени для имитации препятствия, безусловный стимул [УЗИ]) или ассоциацию с сенсорными стимулами (тон, условный стимул [CS]). Тестирование включает в себя два отдельных этапа, каждый из которых оценивает улучшение двигательных характеристик в течение 4 дней, в течение которых мыши проходят сеанс из 42 последовательных испытаний в день. На начальном этапе мышей обучают перемещаться по лестнице, чтобы оценить «хорошее» или «квалифицированное» моторное обучение. Вторая фаза состоит из чередующихся испытаний, где на пути движущегося животного появляется препятствие в виде более высокой ступени. Возмущение может быть неожиданным для оценки «проблемного» моторного обучения (испытания только для США) или сигналом слуха для оценки «ассоциативного» моторного обучения (парные испытания).
Лестница Эразма была разработана относительно недавно 2,3. Он не получил широкого распространения, потому что настройка и оптимизация протокола требовали целенаправленных усилий и был специально разработан для оценки ассоциативного обучения, зависящего от мозжечка, без детального изучения его потенциала для выявления других двигательных дефицитов. На сегодняшний день его способность выявлять тонкие двигательные нарушения, связанные с дисфункцией мозжечка, у мышей 3,4,5,6,7,8. Например, мыши с нокаутом connexin36 (Cx36), у которых в оливарных нейронах нарушены щелевые контакты, демонстрируют дефицит возбуждения из-за отсутствия электротонической связи, но моторный фенотип было трудно определить. Тестирование с использованием лестницы Эразма показало, что роль нижних оливарных нейронов в задаче обучения мозжечковой моторики заключается в кодировании точного временного кодирования стимулов и облегчении зависимых от обучения реакций на неожиданныесобытия. Мышь с нокаутом Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), модель синдрома Fragile-X-Syndrome (FXS), демонстрирует хорошо известные когнитивные нарушения наряду с более легкими дефектами в формировании процедурной памяти. Нокауты Fmr1 не показали существенных различий во времени шагов, ошибках в каждом испытании или улучшении двигательных характеристик по сравнению с занятиями по лестнице Эразма, но не смогли приспособить свой паттерн ходьбы к внезапно появившемуся препятствию по сравнению с их однопометниками дикого типа (WT), что подтверждает специфический дефицит процедурной и ассоциативной памяти 3,5. Кроме того, клеточно-специфические мутантные линии мышей с дефектами функции мозжечка, включая нарушение выхода клеток Пуркинье, потенцирования и выхода клеток интернейронов или гранул молекулярного слоя, демонстрировали проблемы в координации движений с измененным приобретением эффективных шаговых паттернов и в количестве шагов, предпринятых для пересечениялестницы. Травма головного мозга у новорожденных вызывает мозжечковый дефицит обучения и дисфункцию клеток Пуркинье, которые также могут быть обнаружены с помощью лестницы Эразма 7,8.
В этом видео мы представляем подробное пошаговое руководство, в котором подробно описана настройка поведенческой комнаты, протокол поведенческого теста и последующий анализ данных. Этот отчет создан для того, чтобы быть доступным и удобным для пользователя, и разработан специально для помощи новичкам. Этот протокол дает представление о различных фазах двигательной тренировки и ожидаемых двигательных паттернах, которые усваивают мыши. Наконец, в статье предлагается систематический рабочий процесс для анализа данных с использованием мощного нелинейного регрессионного подхода, дополненный ценными рекомендациями и предложениями по адаптации и применению протокола в других исследовательских контекстах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В настоящем исследовании использовались взрослые (2-3 месяца) мыши C57BL/6J обоего пола. Животные содержались от двух до пяти человек в клетке с неограниченным доступом к пище и воде в помещении для животных, за которыми ведется наблюдение, и содержались в среде с контролируемой температурой в течение 12-часового цикла темноты/света. Все процедуры были проведены в соответствии с европейскими и испанскими правилами (2010/63/UE; RD 53/2013) и были одобрены Этическим комитетом Женералитата Валенсианы и Комитетом по благополучию животных Университета Мигеля Эрнандеса.
1. Настройка поведенческой комнаты
- Резервируйте комнату для поведенческого тестирования каждый день в одно и то же время и устанавливайте список и порядок использования мышей, а также организуйте их размещение.
- Держите подопытных мышей за пределами испытательной комнаты, чтобы они не слышали звуков воздушного компрессора и звуковых сигналов Erasmus Ladder, когда их не тестируют.
- Убедитесь, что все компоненты системы Erasmus Ladder в порядке и готовы к использованию: сетевой маршрутизатор, компьютер с программным обеспечением (см. Таблицу материалов), воздушный компрессор, два ящика для ворот и лестница с правильно расположенными перекладинами.
- Тщательно очищайте ящики для ворот, лестницу и перекладины водой после каждого животного и водой с 70% этанолом в конце каждого тренировочного дня.
2. Протокол поведенческого теста
- Создайте эксперимент и введите протокол в программное обеспечение (дополнительный рисунок S1).
- Включите программное обеспечение.
- Чтобы создать эксперимент, выберите Файл | Новый эксперимент | Новый или настроенный | Протокол эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол по умолчанию, используемый в этом исследовании, называется EMC и был разработан в Медицинском центре Университета Эразма в Роттердаме. - Присвойте эксперименту имя и нажмите кнопку ОК.
- Убедитесь, что выбранный протокол ЭМС по умолчанию состоит из 4 дней сеансов без помех (42 испытания без помех в день) и 4 дней сеансов испытаний (42 ежедневных смешанных испытания: без помех, только CS (тональный сигнал), только для США (препятствие), парный (препятствие объявляется звуковым сигналом) (см. рисунок 1B). На правой боковой панели также проверьте световой сигнал (максимальная продолжительность 3 с), воздушный сигнал (максимальная продолжительность 45 с) и попутный ветер (да во всех типах испытаний), используемые для того, чтобы побудить мышь пересечь лестницу, и звуковой сигнал (250 мс, Да только в CS-only и парных испытаниях).
- Чтобы создать другой протокол, выберите Настройка | Протокол эксперимента | Новинка | С нуля или Скопируйте из протокола ЭМС и просто измените его, отредактировав строки таблицы, относящиеся к количеству сеансов (дней эксперимента) и количеству и типу испытаний в день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время отдыха, тип сигналов и активация, длительность, интенсивность и интервал также могут быть адаптированы в соответствии с экспериментальными вопросами. - Чтобы открыть список сеансов и присвоить темам имена, выберите Настройка | Список сеансов.
- Нажмите « Добавить темы и переменные».
- Введите каждый конкретный идентификатор мыши, дату рождения, пол, генотип и соответствующие категории, следуя упорядоченному списку мышей.
- Начните сеанс (дополнительный рисунок S2).
- Перед запуском убедитесь, что программное обеспечение открыто, затем включите Ladder.
- Убедитесь, что воздушный компрессор подключен и включен.
- Чтобы открыть окно Сбор данных, откройте созданный эксперимент.
- Выберите Приобретение | Открытое приобретение.
- Поместите мышь с идентификатором, указанным программным обеспечением, в поле стартовой цели (правая сторона лестницы).
- Выберите идентификатор мыши , который будет получен в первом сеансе.
- Нажмите « Начать приобретение».
- Нажмите красную ручку меню лестницы 3 раза. Убедитесь, что сеанс запускается и автоматически контролирует и записывает движения мыши до конца последней попытки сеанса.
- Завершите сеанс.
- Убедитесь, что в конце42-й попытки на дисплее отображаются сообщения Sending Data (Отправка данных ) и Acquired (Получено).
- Верните мышь в домашнюю клетку.
- Очистите лестницу и ящики для ворот.
- Поместите следующую мышь и повторите, начиная с шага 2.2.6.
- Выполняйте выбранный тип сеанса каждый день до конца протокола. Повторяйте шаги 2.2 и 2.3 каждый день в соответствии с выбранным протоколом.
- Экспортируйте данные (дополнительный рисунок S2).
- Чтобы визуализировать записанные данные, выберите в меню «Анализ » « Статистика пробной версии», «Статистика сеанса» и «Групповая статистика и диаграммы».
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть загружены в виде электронной таблицы с данными по отдельным испытаниям и средними значениями для тех же типов испытаний в рамках сеанса. Сеансы также могут быть отфильтрованы по переменным, выбранным для конкретного анализа. - Нажмите кнопку «Экспорт» в правом верхнем углу, выбрав формат файла (таблицу) и расположение папки.
- Щелкните правой кнопкой мыши по автоматически сгенерированным диаграммам и выберите «Сохранить в файл как *.jpg».
- Чтобы визуализировать записанные данные, выберите в меню «Анализ » « Статистика пробной версии», «Статистика сеанса» и «Групповая статистика и диаграммы».
3. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Лестница Эразмуса автоматически измеряет список параметров на основе мгновенной записи действий сенсорных датчиков. Для анализа выходные параметры, выбранные пользователем, организуются и обрабатываются в электронных таблицах. Наряду с графиками, сгенерированными программным обеспечением, пользователи могут создавать графики с помощью выбранного программного обеспечения для построения графиков для визуализации конкретных изменений различных параметров в течение сеансов.
- Выберите конкретные параметры для анализа базальной мотивации или тревожных состояний, сенсорных реакций, моторики и обучения мелкой моторике в течение первых 4 дней.
- Выберите и постройте график управляющих параметров, включая время отдыха в поле ворот и время выхода из поля ворот после периода отдыха в ответ на сигналы света и воздуха (рис. 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время покоя или реакция на сигналы относительно постоянны у мышей WT. Другие параметры, такие как частота выходов, в основном пренебрежимо малы у мышей WT - животные редко покидают бокс отдыха без сигналов или возвращаются один раз в лестнице, что приводит к частоте выхода, равной 1 за попытку. Если животное выходит на улицу до того, как будут применены сигналы, активируется воздушный поток, заставляющий мышь вернуться к воротам; Это не считается пробной версией программного обеспечения. - Выберите и постройте график времени на лестнице после сигналов, измеряемого как время, затраченное на пересечение лестницы после того, как мышь покинула поле ворот (рис. 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Степенная нелинейная регрессия является надежным методом оценки обучения. Коэффициенты Пирсона или Спирмена (R) обеспечивают меру того, является ли подгонка данных хорошей (значения R, близкие к единице, когда животные обучаются/совершенствуются в течение сеансов; Значения R, близкие к 0, означают, что данные постоянны и мыши не обучаются. - Выберите и постройте график параметров пошагового шаблона , таких как процент проб с ошибками , в качестве чувствительного параметра обучения (рис. 2C) .
- Определите правильный шаг как шаг от верхней ступени до другой высокой ступени (H-H), независимо от длины шага. Считайте, что типы шагов, включающие более низкую ступень, являются ошибками.
- Разделите правильные шаги и оплошности на короткие и длинные шаги, шаги назад и прыжки в зависимости от длины и направленности шага между нажатыми ступенями (см. рис. 1А).
- Выберите и постройте график управляющих параметров, включая время отдыха в поле ворот и время выхода из поля ворот после периода отдыха в ответ на сигналы света и воздуха (рис. 2A).
- Выберите и постройте график для оценки проблемного моторного обучения (испытания только в США) и ассоциативного обучения (парные испытания) за последние 4 дня.
- Выберите и постройте график времени на лестнице после подсказок (рис. 3).
- Выберите и постройте график процента испытаний с ошибками (рис. 4A).
- Выберите и постройте график времени шага до и после возмущения, определяемого как разность точности в мс между активацией ступени непосредственно перед (контрольный шаг) и после препятствия (адаптированный шаг) на той же стороне лестницы (рисунок 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения данных внутри каждого типа сеанса необходимо провести анализ времени шага до и после возмущения. Параметр измеряет способность мышей предсказывать и преодолевать препятствия во время ассоциативного обучения.
- Анализируйте данные с помощью специального статистического программного обеспечения (например, SigmaPlot). Выполняйте силовой нелинейный регрессионный анализ данных, собранных из одного и того же типа испытания в разных сессиях, чтобы более эффективно описать процесс обучения, и используйте двусторонние повторные измерения (RM) ANOVA для сравнения типов испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Устройство, настройка и протокол Erasmus Ladder представлены на рисунке 1. Протокол состоит из четырех спокойных и четырех пробных сессий (по 42 испытания в каждой). Каждое испытание представляет собой одну пробежку по лестнице между стартовой и конечной ячейками ворот. В начале сеанса мышь помещается в один из стартовых боксов. По истечении установленного времени 15 ± 5 с («состояние покоя») включается свет (сигнал 1, максимум на 3 с). Затем применяется легкий воздушный сигнал (сигнал 2, максимум 45 с), чтобы побудить мышей покинуть коробку и перейти к противоположному концу. Время реакции на сигнал воздуха может варьироваться в зависимости от мышей и сеансов и может быть использовано в качестве параметра для сравнения состояний мотивации или тревоги между группами. Новое испытание запускается сразу после того, как мышь достигнет конечного целевого поля.
У мышей WT в течение 1-4 дней не наблюдалось различий во времени покоя и времени реагирования на световой сигнал, но время реакции на сигнал воздуха немного уменьшилось между 1-м и 2-м днями (рис. 2A). Измерения времени, затрачиваемого на преодоление лестницы, дали значительную кривую обучения с 1-го по 4-й дни, которую можно было подстроить с помощью кривой степенной регрессии (R = 0,50, *p = 0,047, рис. 2B). Ключевым параметром, определяющим время, необходимое для пересечения лестницы, является наличие ошибок. В соответствии с сокращением времени нахождения на лестнице, количество испытаний, в которых мыши совершали оплошности, уменьшилось по сравнению с сеансами без помех, поскольку мыши научились ходить по верхним ступеням (ступеням H-H) и избегать нижних как более эффективной модели для пересечения лестницы (R = 0,90, ***p < 0,0001, рис. 2C).
С 5-го по 8-й день мышей подвергали сеансам испытаний, в ходе которых вводилось неожиданное препятствие (УЗ) (одна ступенька случайным образом поднималась на 18 мм над поверхностью ступеней). В некоторых испытаниях тон (CS, 90 дБ, тон 15 кГц длительностью 250 мс) подается за 250 мс до возмущения УЗИ (см. рис. 1B).
С началом контрольных сессий на 5-й день животным требовалось больше времени, чтобы пересечь лестницу во время испытаний, проводимых только в США, из-за непредвиденного появления препятствия (день 4: 5,01 с; Рисунок 2Б; день 5: 7,84 с; Рисунок 3; парный t-критерий,*p < 0,039). Производительность мыши улучшилась с 5-го по 8-й день, что привело к значительной кривой обучения во время сеансов только в США (R = 0,50, *p = 0,045, рис. 3, оранжевый). В исследованиях ассоциативного обучения, где препятствие сочеталось с тоном, животные выполняли ежедневные сеансы значительно быстрее по сравнению с испытаниями, проводимыми только в США (R = 0,63, рис. 3, фиолетовый; двусторонний RM ANOVA, *p = 0,028). Наконец, в контрольных испытаниях, когда тон подавался отдельно (только CS-only), сообщалось о значительной кривой обучения, которая напоминала спокойные сеансы (R = 0,82, ***p < 0,001, рис. 3, синий).
Анализ паттернов шагов обеспечил дополнительное подтверждение и повышенную чувствительность в выявлении различий между исследованиями, проводимыми только УЗИ и ассоциативными исследованиями. На рисунке 4A показано, как процент испытаний с ошибками оставался неизменным во время испытаний, проведенных только в США (R = 0,01, p = 0,90, оранжевый цвет), в то время как значительное снижение количества испытаний с ошибками наблюдалось во время парных сессий (R = 0,61, *p = 0,01, фиолетовый цвет). На рисунке 4B показана существенная разница между временем шага до и после возмущения в исследованиях, проведенных только в США (двусторонний RM ANOVA, *p = 0,05), но не в парных испытаниях, где мыши быстрее учились преодолевать препятствие. Все изученные переменные и примененные статистические критерии представлены в Дополнительной таблице S1.
Рисунок 1: Система, протокол и параметры. (A) Лестница Эразма состоит из горизонтальной лестницы, окруженной двумя воротами. Мультфильм представляет собой лестницу с чередующимися высокими и низкими ступенями и основными записываемыми параметрами, включая типы шагов (нормальные шаги, закрашенная линия; или неверные шаги, пунктирная линия) и время шага до и после возмущения, определяемое как время, необходимое мыши для преодоления препятствия (безусловный стимул; более высокая ступень), объявленное или не объявленное тоном (условный стимул). (B) Протокол состоит из четырех ненарушенных и четырех промежуточных сессий (одна сессия в день, 42 попытки/сессия), которые позволяют отдельно анализировать обучение мелкой моторики (без нарушений и только CS синего цвета), проблемное моторное обучение (только для УЗИ, оранжевый) и ассоциативное моторное обучение (парное CS + УЗИ, фиолетовое). Сокращения: H = высокий; L = низкий; CS = условный раздражитель; США = безусловный стимул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Двигательная активность мышей WT во время сеансов без помех . (А) Время отдыха в штрафной (постоянное, 15 с), время реакции на сигналы: свет (постоянный, 3 с) и воздух (переменный); в течение 1-4 дней спокойных сеансов. (Б) Время, необходимое для пересечения лестницы после сигнала (света и воздуха) во время спокойных сеансов. (C) Процент испытаний в каждом сеансе без помех, в которых животное пропустило шаг. Для изучения прогресса в обучении был использован степенной регрессионный анализ (R= 0,50: *p = 0,047, R= 0,90 ***p < 0,0001 соответственно, n = 4 мыши). Аббревиатура: WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Производительность мышей WT во время тестовых сессий. Среднее время нахождения в ладдере после сигналов в течение 5-8 дней для испытаний только для США (оранжевый), парный (фиолетовый) и только для CS (голубой). Для изучения хода обучения использовался силовой нелинейный регрессионный анализ (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n=4 мыши). Двусторонний RM ANOVA для сравнения типов испытаний (*p = 0,028, **p = 0,008, n=4 мыши, два самца и две самки, среднее значение ± SEM). Сокращения: CS = условный раздражитель; США = безусловный стимул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изменения в паттернах шагов мыши во время сеансов испытаний. (A) Процент испытаний за сеанс, в которых животное пропустило шаг во время сеансов только в США и в паре. Для изучения процесса обучения был использован степенной регрессионный анализ (*p = 0,013) и двуфакторный RM ANOVA для сравнения типов испытаний (*p = 0,032, n = 4 мыши). (B) Время шага (ов) до и после возмущения в сеансах только для США и в парных сеансах на протяжении всех сеансов. Двусторонние повторные измерения ANOVA, *p < 0,05, n = 4 мыши, два самца и две самки, среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Программный интерфейс: как создать эксперимент и выбрать протокол. Снимки экрана из программного обеспечения, иллюстрирующие рабочий процесс, описанный на шаге протокола 2.1, охватывающий шаги с 2.1.4 по 2.1.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Программный интерфейс: как запустить сессию и экспортировать данные. Снимки экрана из программного обеспечения, иллюстрирующие рабочий процесс, описанный в шагах протокола 2.2 и 2.5, охватывающие шаги 2.2.4–2.2.7 и 2.5.1–2.5.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S1: Статистическая таблица. Описание всех изученных переменных и примененных статистических тестов представлено на рисунке 2B, C, рисунке 3 и рисунке 4A, B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лестница Эразма предоставляет значительные преимущества для оценки моторного фенотипа по сравнению с существующими подходами. Тестирование легко проводить, оно автоматизировано, воспроизводимо и позволяет исследователям оценивать различные аспекты двигательного поведения по отдельности, используя одну когорту мышей. В настоящем исследовании воспроизводимость позволила получить надежные данные с небольшим количеством мышей WT, используя преимущества устройства, дизайна эксперимента и методов анализа. Например, по сравнению с традиционными методами обхода по лучу, добавление мотивационных сигналов (воздуха и света) для входа на траекторию лестницы и попутного ветра для завершения испытания повышает согласованность и устраняет необходимость вмешательства экспериментатора, который является основным источником изменчивости.
Система воздушного компрессора необходима для создания воздушного потока, который можно регулировать в соответствии с направлением и положением мыши. Воздушный поток создает встречный ветер со скоростью 30 км/ч с противоположного направления, когда мышь пытается покинуть штрафную до запланированного начала испытаний, заставляя мышей вернуться в штрафную ворот. Он также создает постоянный попутный ветер (от 1 до 16 км/ч) во время испытания до тех пор, пока мышь полностью не пересечет лестницу и не войдет в противоположную коробку ворот. Без сжатого воздуха в качестве стимула для пересечения лестницы мыши часто останавливаются на ступеньках и меняют направление в неторопливом темпе, что приводит к исследовательской переменной, контрпродуктивной для анализа.
Стандартный протокол, описанный здесь, обеспечивает измерение базовой координации мелкой моторики и обучения (сеансы без помех), а также адаптации к задачам и ассоциативно-моторного обучения (сеансы с заданиями) в течение 8 дней. Задача проста для линий мышей WT, обычно используемых для нейробиологических исследований, таких как мыши C57Bl6J, используемые здесь, и безопасна, без каких-либо травм, наблюдаемых ни в одном из сеансов тестирования. Кроме того, мы не обнаружили признаков усталости по сравнению с другими моторными тестами, такими как ротарод или беговая дорожка.
В течение 4-дневной начальной фазы мыши WT овладевают навыком и пересекают лестницу, учась принимать наиболее эффективный режим бега (шаги H-H), и к 4-му дню ошибки случаются редко (рис. 2B, C). На 5-й день второй фазы мыши медленнее, когда они впервые сталкиваются с препятствием, но быстро адаптируются (рис. 3, только для США). Сочетание препятствия с условным стимулом (тоном) облегчает обучение в той степени, в которой продолжительность испытания равна продолжительности испытаний, в которых препятствие не представлено (рис. 3, в паре). Следует отметить, что число испытаний с ошибками оставалось неизменным во всех исследованиях, проведенных только в США (рис. 4А), в то время как значительное снижение наблюдалось в парных сессиях (рис. 4А), что подтверждает эффективность ассоциативного процесса обучения.
Предложен рабочий процесс для анализа репрезентативных параметров, предоставляемый программным обеспечением Erasmus Ladder. Степенной регрессионный анализ позволил нам зарегистрировать значимые кривые обучения и обнаружить различия в сложном и ассоциативном обучении с использованием четырех мышей WT. Основываясь на дополнительной литературе и пилотных экспериментах, экспериментальные схемы с участием мутантных или обработанных мышей могут потребовать увеличения численности мышей до 7-10 мышей 4,5,6. В нашем распоряжении 42 испытания за сеанс было оптимальным числом для получения надежных данных с небольшой когортой мышей, поскольку усреднение нескольких испытаний снижает вариабельность. Хотя это число может показаться завышенным, каждые 42 пробных сеанса занимают от 15 до 35 минут, и в день можно тестировать 12-16 мышей. Продолжительность испытания (включая время отдыха и реакцию на сигналы, а также время прохождения лестницы) варьируется от 20 до 50 секунд, в зависимости от дня тренировки и типа испытания.
Тем не менее, универсальность системы позволит исследователям разрабатывать индивидуальные протоколы, регулируя различные параметры, включая количество сеансов и испытаний в день, интенсивность и продолжительность сигналов и CS, а также характер США. Например, наши данные показали быструю кривую обучения у мышей WT, особенно между 1-м и 2-м днем после того, как производительность достигает плато (рис. 2B, C). Это говорит о том, что дополнительные 2 дня, возможно, не являются строго необходимыми для тестирования базового моторного обучения в спокойных сессиях, и изменения в стандартном протоколе могут быть реализованы путем сокращения продолжительности тренировки до 2 дней. Тем не менее, эта адаптация может не подходить для второй фазы протокола, которая включает в себя чередующиеся ненарушенные испытания, только для США, только для КС и парные испытания. Стимулы предъявляются случайным образом и неожиданно для оценки конкретного поведения, и необходимость разделения экспериментальных испытаний на эти четыре категории делает 42 испытания подходящим числом испытаний, необходимым для статистической силы. Таким образом, при реорганизации протокола необходимо будет оценить целесообразность сокращения числа ненарушенных испытаний или увеличения числа испытаний с конкретными вызовами. Межстимульный интервал (ISI) между CS (90 дБ, тон 15 кГц) и US, установленный здесь на уровне 250 мс, также может варьироваться для изучения связи стимул-реакция. Такого рода корректировка позволит исследователям титровать уровень сложности или сосредоточиться на различных моделях поведения в соответствии с научным вопросом.
На сегодняшний день лестница Эразма в основном используется для выявления тонких дефектов координации движений мозжечкового происхождения. Например, неверные шаги являются мерой локомоторной координации всего тела. В этом исследовании использовались молодые взрослые мыши, но мыши в возрасте P23 использовались другими для изучения созревания локомоторных функций 7,8. Ипсилатеральные патологии центрального происхождения могут быть изучены с помощью дискриминационного анализа положения правой и левой лап мыши. Наконец, овладение моторикой по лестнице Эразма, вероятно, задействует другие цепи управления моторикой, включая базальные ганглии, моторную кору и соединительные пути, включая мозолистое тело. Сочетание этой поведенческой парадигмы с клеточными, молекулярными и схемными методами будет полезно для изучения механизмов, которые опосредуют моторную адаптацию и могут быть использованы для ускорения моторного обучения. Одним из таких примеров может быть изучение влияния на аксональную миелинизацию, которая очень чувствительна к приобретению мелкой моторики в мышиных моделях демиелинизации 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Выражаем признательность аудиовизуальному технику и видеопродюсеру Ребеке Де лас Эрас Понсе, а также главному ветеринарному врачу Гонсало Морено дель Валю за надзор за надлежащей практикой во время экспериментов на мышах. Работа финансировалась за счет грантов Программы передового опыта GVA (2022/8) и Испанского исследовательского агентства (PID2022143237OB-I00) Исабель Перес-Отаньо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- Noldus. , https://www.noldus.com/erasmusladder (2023).
- Cupido, A., et al. Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , Erasmus University Rotterdam PhD dissertation. (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
