Övervakning av fin- och associativ motorisk inlärning hos möss med hjälp av Erasmustrappan

Summary

Den här artikeln presenterar ett protokoll som möjliggör en icke-invasiv och automatiserad bedömning av finmotorisk prestanda, samt adaptiv och associativ motorisk inlärning vid utmaningar, med hjälp av en enhet som kallas Erasmus Ladder. Uppgiftens svårighetsgrad kan titreras för att upptäcka motorisk funktionsnedsättning som sträcker sig från större till subtila grader.

Abstract

Beteende formas av handlingar, och handlingar kräver motoriska färdigheter som styrka, koordination och inlärning. Inget av de beteenden som är nödvändiga för att upprätthålla livet skulle vara möjliga utan förmågan att övergå från en position till en annan. Tyvärr kan motoriken äventyras vid ett brett spektrum av sjukdomar. Därför är det avgörande att undersöka mekanismerna för motoriska funktioner på cell-, molekyl- och kretsnivå, samt att förstå symtom, orsaker och progression av motoriska störningar, för att utveckla effektiva behandlingar. Musmodeller används ofta för detta ändamål.

I den här artikeln beskrivs ett protokoll som gör det möjligt att övervaka olika aspekter av motorisk prestation och inlärning hos möss med hjälp av ett automatiserat verktyg som kallas Erasmusstegen. Analysen består av två faser: en första fas där möss tränas att navigera på en horisontell stege byggd av oregelbundna stegpinnar ("finmotorisk inlärning"), och en andra fas där ett hinder presenteras i vägen för det rörliga djuret. Störningen kan vara oväntad ("utmanad motorisk inlärning") eller föregås av en auditiv ton ("associativ motorisk inlärning"). Uppgiften är lätt att utföra och stöds fullt ut av automatiserad programvara.

Denna rapport visar hur olika avläsningar från testet, när de analyseras med känsliga statistiska metoder, möjliggör finövervakning av musmotorik med hjälp av en liten kohort av möss. Vi föreslår att metoden kommer att vara mycket känslig för att utvärdera motoriska anpassningar som drivs av miljöförändringar samt subtila motoriska brister i tidiga stadier hos muterade möss med nedsatt motorisk funktion.

Introduction

En mängd olika tester har utvecklats för att bedöma motoriska fenotyper hos möss. Varje test ger information om en specifik aspekt av motoriskt beteende¹. Till exempel informerar det öppna fälttestet om allmän rörelse och ångesttillstånd; Rotarod- och gångbalkstesterna för koordination och balans. Fotavtrycksanalys handlar om gång; löpbandet eller löphjulet vid påtvingad eller frivillig fysisk träning; Och det komplexa hjulet handlar om motorisk inlärning. För att analysera musmotoriska fenotyper måste utredarna utföra dessa tester sekventiellt, vilket innebär mycket tid och ansträngning och ofta flera djurkohorter. Om det finns information på cell- eller kretsnivå väljer utredaren normalt ett test som övervakar en relaterad aspekt och följer därifrån. Det saknas dock paradigm som särskiljer olika aspekter av motoriskt beteende på ett automatiserat sätt.

I den här artikeln beskrivs ett protokoll för att använda Erasmus Ladder ^2,3, ett system som möjliggör omfattande bedömning av en mängd olika motoriska inlärningsfunktioner hos möss. De främsta fördelarna är metodens reproducerbarhet och känslighet, tillsammans med förmågan att titrera motoriska svårigheter och att separera brister i motorisk förmåga från nedsatt associativ motorisk inlärning. Huvudkomponenten består av en horisontell stege med omväxlande höga (H) och låga (L) stegpinnar utrustade med beröringskänsliga sensorer som känner av musens position på stegen. Stegen är gjord av 2 x 37 stegpinnar (L, 6 mm; H, 12 mm) med 15 mm mellanrum från varandra och placerade i ett alternerande mönster från vänster till höger med 30 mm mellanrum (figur 1A). Stegpinnar kan flyttas individuellt för att generera olika svårighetsgrader, det vill säga skapa ett hinder (höja de höga stegpinnarna med 18 mm). Tillsammans med ett automatiserat registreringssystem och associering av modifieringar av stegpinnens mönster med sensoriska stimuli, testar Erasmus-stegen finmotorisk inlärning och anpassning av motorisk prestanda som svar på miljöutmaningar (utseendet på en högre pinne för att simulera ett hinder, ett obetingat stimulus [US]) eller association med sensoriska stimuli (en ton, ett betingat stimulus [CS]). Testningen omfattar två distinkta faser, som var och en bedömer förbättring av motorisk prestanda under 4 dagar, under vilka möss genomgår en session med 42 på varandra följande försök per dag. I den inledande fasen tränas möss att navigera på stegen för att bedöma "fin" eller "skicklig" motorisk inlärning. Den andra fasen består av interfolierade försök där ett hinder i form av en högre pinne presenteras i vägen för det rörliga djuret. Störningen kan vara oväntad för att bedöma "utmanad" motorisk inlärning (endast USA-studier) eller meddelas av en auditiv ton för att bedöma "associativ" motorisk inlärning (parade försök).

Erasmustrappan har utvecklats relativt nyligen ^2,3. Det har inte använts i stor utsträckning eftersom det krävdes fokuserad ansträngning för att ställa in och optimera protokollet och var speciellt utformat för att bedöma cerebellär beroende associativ inlärning utan att i detalj utforska dess potential att avslöja andra motoriska brister. Hittills har den validerats för sin förmåga att avslöja subtila motoriska funktionsnedsättningar kopplade till cerebellär dysfunktion hos möss 3,4,5,6,7,8. Till exempel visar connexin36 (Cx36) knockout-möss, där gap junctions är nedsatta i olivneuroner, avfyrningsunderskott på grund av brist på elektrotonisk koppling, men den motoriska fenotypen hade varit svår att fastställa. Tester med hjälp av Erasmus-stegen tyder på att rollen för underlägsna olivnervceller i en cerebellär motorisk inlärningsuppgift är att koda exakt tidsmässig kodning av stimuli och underlätta inlärningsberoende svar på oväntade händelser ^3,4. Fragil X Messenger Ribonukleoprotein 1 (Fmr1) knockoutmus, en modell för Fragile-X-syndrom (FXS), uppvisar en välkänd kognitiv försämring tillsammans med mildare defekter i procedurminnesbildning. Fmr1-knockouts visade inga signifikanta skillnader i stegtider, felsteg per försök eller förbättrad motorisk prestation jämfört med sessioner i Erasmusstegen, men misslyckades med att anpassa sitt gångmönster till det plötsligt uppdykande hindret jämfört med deras kullsyskon av vildtyp (WT), vilket bekräftar specifika procedurella och associativa minnesbrister ^3,5. Dessutom uppvisade cellspecifika musmutantlinjer med defekter i lillhjärnans funktion, inklusive försämrad Purkinje-cellproduktion, potentiering och molekyllagerinterneuron- eller granulcellutgångar, problem i motorisk koordination med förändrad inlärning av effektiva stegmönster och i antalet steg som togs för att korsa stegen⁶. Hjärnskada hos nyfödda orsakar inlärningssvårigheter i lillhjärnan och Purkinjecelldysfunktion som också kunde upptäckas med Erasmus Ladder ^7,8.

I den här videon presenterar vi en omfattande steg-för-steg-guide som beskriver installationen av beteenderummet, beteendetestprotokollet och efterföljande dataanalys. Denna rapport är utformad för att vara tillgänglig och användarvänlig och är utformad speciellt för att hjälpa nykomlingar. Detta protokoll ger insikt i olika faser av motorisk träning och förväntade motoriska mönster som möss antar. Slutligen föreslår artikeln ett systematiskt arbetsflöde för dataanalys med hjälp av en kraftfull icke-linjär regressionsmetod, komplett med värdefulla rekommendationer och förslag för att anpassa och tillämpa protokollet i andra forskningssammanhang.

Protocol

I den aktuella studien användes vuxna (2-3 månader gamla) C57BL/6J-möss av båda könen. Djuren inhystes två till fem per bur med fri tillgång till mat och vatten i en djurenhet under observation och hölls i en temperaturkontrollerad miljö under en 12 timmars mörker/ljuscykel. Alla förfaranden genomfördes i enlighet med de europeiska och spanska bestämmelserna (2010/63/EU; RD 53/2013) och godkändes av den etiska kommittén vid Generalitat Valenciana och djurskyddskommittén vid Universidad Miguel Hernández.

1. Inställning av beteenderum

1. Boka beteendetestrummet varje dag vid samma tidpunkt och upprätta listan och ordningen på möss som ska användas, samt arrangemang för deras värdskap.
2. Håll försöksmössen utanför testrummet så att de inte hör ljuden från luftkompressorn och Erasmus Ladder-tonerna när de inte testas.
3. Kontrollera att alla komponenter i Erasmus Ladder-systemet är i ordning och redo att användas: nätverksroutern, datorn med programvaran (se Materialtabell), luftkompressorn, två mållådor och stegen med stegpinnarna korrekt placerade.
4. Rengör målboxarna, stegen och stegpinnarna noggrant med vatten efter varje djur och med vatten och 70 % etanol i slutet av varje träningsdag.

2. Protokoll för beteendetest

1. Skapa ett experiment och mata in protokollet i programvaran (tilläggsfigur S1).
   1. Slå på programvaran.
   2. Om du vill skapa ett experiment väljer du Arkiv | Nytt experiment | Ny eller konfigurerad | Protokoll för experiment.
      OBS: Standardprotokollet, som används i denna studie, heter EMC och designades vid Erasmus University Medical Center, Rotterdam.
   3. Ge experimentet ett namn och klicka på OK.
   4. Kontrollera att det valda EMC-standardprotokollet består av 4 dagars ostörda sessioner (42 ostörda försök per dag) och 4 dagars utmaningssessioner (42 dagliga blandade försök: ostörda, endast CS (ton), endast USA (hinder), Parad (hinder meddelas med ton) (se figur 1B). I den högra sidopanelen, kontrollera också ljussignalen (3 s maximal varaktighet), luftsignal (45 s maximal varaktighet) och medvind (Ja i alla försökstyper), som används för att uppmuntra musen att korsa stegen, och tonen (250 ms, Ja endast i CS-only och parade försök).
   5. Om du vill skapa ett annat protokoll väljer du Konfigurera | Protokoll för experiment | Nyhet | Från grunden eller kopiera från EMC-protokollet och ändra det helt enkelt, redigera tabellraderna relaterade till antal sessioner (experimentdagar) och antal och typ av försök per dag.
      OBS: Vilotid, signaltyp och aktivering, varaktighet, intensitet och intervall kan också anpassas efter de experimentella frågorna.
   6. Om du vill öppna sessionslistan och namnge ämnena väljer du Inställningar | Lista över sessioner.
   7. Klicka på Lägg till ämnen och variabler.
   8. Ange varje specifik musidentifierare, födelsedatum, kön, genotyp och relevanta kategorier enligt den ordnade listan över möss.
2. Starta sessionen (kompletterande figur S2).
   1. Innan du börjar, kontrollera att programvaran är öppen och slå sedan på stegen.
   2. Kontrollera att luftkompressorn är ansluten och påslagen.
   3. Öppna fönstret Förvärv genom att öppna Experiment skapat.
   4. Välj Förvärv | Öppna Förvärv.
   5. Placera musen med identifieraren som anges av programvaran i startmålsrutan (höger sida av stegen).
   6. Välj den musidentifierare som ska hämtas i den första sessionen.
   7. Klicka på Starta förvärv.
   8. Tryck på den röda stegens menyratt 3x. Kontrollera att sessionen startar och automatiskt styr och registrerar musrörelser fram till slutet av den sista testversionen av sessionen.
3. Avsluta sessionen.
   1. Kontrollera att i slutet av den 42^:a försöket visar displayen meddelandena Skickar data och Hämtad.
   2. Sätt tillbaka musen i hemburen.
   3. Rengör stegen och mållådorna.
   4. Placera nästa mus och upprepa från steg 2.2.6 och framåt.
4. Utför den valda typen av session varje dag fram till slutet av protokollet. Upprepa steg 2.2 och 2.3 varje dag enligt det valda protokollet.
5. Exportera data (tilläggsfigur S2).
   1. Om du vill visualisera inspelad data väljer du från menyn Analys , Provstatistik, Sessionsstatistik och Gruppstatistik och diagram.
      Data kan laddas ner som ett kalkylblad med data för enskilda prövningar och medelvärden för samma prövningstyper inom en session. Sessioner kan också filtreras efter variabler som valts för specifik analys.
   2. Klicka på knappen Exportera i det övre högra hörnet och välj filformat (kalkylblad) och mappplats.
   3. Högerklicka på de automatiskt genererade diagrammen och välj Spara i fil som *.jpg.

3. Analys av data

OBS: En lista med parametrar mäts automatiskt av Erasmusstegen baserat på den momentana registreringen av de beröringskänsliga sensorernas aktiviteter. För analys organiseras och bearbetas utdataparametrar som valts av användaren i kalkylbladen. Tillsammans med de programvarugenererade graferna kan användare generera grafer med hjälp av valfri grafprogramvara för att visualisera specifika förändringar i olika parametrar under sessioner.

1. Välj specifika parametrar för att analysera basala motivations- eller ångesttillstånd, sensoriska reaktioner, motorisk prestanda och finmotorisk inlärning under de första 4 dagarna.
   1. Välj och plotta kontrollparametrar, inklusive vilotid i målrutan och tid för att lämna målrutan efter viloperioden som svar på ljus- och luftsignaler (Figur 2A).
      OBS: Vilotider eller respons på signaler är relativt konstanta hos WT-möss. Andra parametrar som t.ex. frekvensen av utträden är i princip försumbara hos WT-möss - djuren lämnar sällan viloboxen utan signaler eller kommer tillbaka en gång i stegen, vilket resulterar i frekvenser av utträde lika med 1 per försök. Om ett djur slocknar innan signaler ges, aktiveras ett luftflöde som tvingar musen att återvända till målrutan; Detta räknas inte som en testversion av programvaran.
   2. Välj och plotta tiden på stegen efter ledtrådar, mätt som den tid som tillbringats över stegen när musen lämnar målrutan (Figur 2B).
      En icke-linjär regression är en robust metod för att utvärdera inlärning. Pearson- eller Spearman-koefficienterna (R) kommer att ge ett mått på om dataanpassningen är bra (R-värden nära ett när djuren lär sig/förbättras under sessioner; R-värden nära 0 innebär att data är konstanta och att möss inte lär sig).
   3. Välj och plotta parametrar för stegmönster , t.ex. procentandelen försök med felsteg som en känslig inlärningsparameter (figur 2C).
      1. Definiera ett korrekt steg som ett steg från ett högt steg till ett annat högt steg (H-H), oavsett stegets längd. Betrakta stegtyper som involverar en lägre stegpinne som felsteg.
      2. Dela upp korrekta steg och felsteg i korta och långa steg, backsteg och hopp beroende på längden och riktningen på steget mellan de nedtryckta stegpinnarna (se figur 1A).
2. Välj och plotta specifika parametrar för att utvärdera utmanad motorisk inlärning (endast USA-försök) och associativ inlärning (parade försök) under de senaste 4 dagarna.
   1. Välj och plotta tiden på stegen efter ledtrådar (figur 3).
   2. Välja ut och plotta procentandelen försök med felsteg (Figur 4A).
   3. Välj och plotta tiderna för steg före och efter störning, definierade som en skillnad i precision mellan stegaktiveringen strax före (kontrollsteget) och efter hindret (anpassat steg) på samma sida av stegen (figur 4B).
      OBS: Stegtidsanalys före kontra efter störning bör utföras för att jämföra data inom varje typ av session. Parametern mäter mössens förmåga att förutsäga och övervinna hindren under associativ inlärning.
3. Analysera data med dedikerad statistisk programvara (t.ex. SigmaPlot). Utför en icke-linjär regressionsanalys av data som samlats in från samma försökstyp över sessioner för att beskriva inlärningsprocessen mer effektivt och använd Two-Way Repeated Measures (RM) ANOVA för att jämföra mellan försökstyper.

Representative Results

Erasmusstegen, installationen och det protokoll som tillämpas visas i figur 1. Protokollet består av fyra ostörda och fyra utmaningssessioner (42 försök vardera). Varje försök är en löpning på stegen mellan start- och slutmålsrutorna. I början av sessionen placeras en mus i en av startrutorna. Efter en inställd tid på 15 ± 5 s ("viloläge") tänds ljuset (signal 1, i maximalt 3 s). En lätt luftsignal (kö 2, max 45 s) appliceras sedan för att uppmuntra mössen att lämna lådan och gå till motsatt ände. Tiden för att svara på luftsignalen kan variera mellan möss och sessioner och kan användas som en parameter för att jämföra motivations- eller ångesttillstånd mellan grupper. En ny testversion startas omedelbart när musen når slutmålsrutan.

Inga skillnader i vilotid och tid för att svara på ljussignalen observerades hos WT-möss mellan dag 1-4, men tiden för att svara på luftsignalen minskade något mellan dag 1 och 2 (Figur 2A). Mätningar av tiden för att korsa stegen gav en signifikant inlärningskurva från dag 1 till 4 som kunde förses med en effektregressionskurva (R = 0,50, *p = 0,047, Figur 2B). En nyckelparameter som avgör hur lång tid det tar att korsa stegen är förekomsten av felsteg. I takt med att tiderna på stegen förkortades minskade antalet försök där möss gjorde felsteg under ostörda sessioner när mössen lärde sig att gå på de övre stegpinnarna (H-H-stegen) och undvika de nedre som ett mer effektivt mönster för att korsa stegen (R = 0,90, ***p < 0,0001, figur 2C).

Från dag 5 till 8 utsattes mössen för utmaningssessioner där ett oväntat hinder (US) introducerades (ett steg höjs slumpmässigt med 18 mm över stegytan). I vissa försök presenteras en ton (CS, 90 dB, 15 kHz ton som varar 250 ms) 250 ms före den amerikanska störningen (se figur 1B).

I början av utmaningssessionerna på dag 5 behövde djuren mer tid för att korsa stegen under försök endast i USA på grund av den oförutsedda introduktionen av hindret (dag 4: 5,01 s; Figur 2B; Dag 5: 7.84 s; Figur 3; parat T-test, *p < 0,039). Musens prestanda förbättrades från dag 5 till 8, vilket gav en betydande inlärningskurva över sessioner endast i USA (R = 0,50, *p = 0,045, figur 3, orange). I försök med associativ inlärning, där hindret parades ihop med en tonus, slutförde djuren de dagliga sessionerna betydligt snabbare jämfört med försök med enbart USA (R = 0,63, Figur 3, lila; tvåvägs RM ANOVA, *p = 0,028). Slutligen, i kontrollstudier där tonen presenterades ensam (endast CS), rapporterades en signifikant inlärningskurva som liknade ostörda sessioner (R = 0,82, ***p < 0,001, Figur 3, blå).

Analys av stegmönstren gav ytterligare bekräftelse och ökad känslighet för att upptäcka skillnader mellan studier som endast genomfördes i USA och associativa studier. Figur 4A visar hur andelen försök med felsteg förblev konstant under alla studier som endast genomfördes i USA (R = 0,01, p = 0,90, orange), medan en signifikant minskning av försök med felsteg observerades under parade sessioner (R = 0,61, *p = 0,01, lila). Figur 4B visar en signifikant skillnad mellan stegtider före och efter störning i studier endast i USA (tvåvägs RM ANOVA, *p = 0,05) men inte i parade försök där möss lärde sig snabbare att övervinna hindret. Alla variabler som studerats och de statistiska tester som använts redovisas i tilläggstabell S1.

Figur 1: System, protokoll och parametrar. (A) Erasmusstegen består av en horisontell stege flankerad av två mållådor. Teckningen representerar stegen med omväxlande höga och låga stegpinnar och de viktigaste parametrarna som registreras, inklusive stegtyper (normala steg, fylld linje; eller felsteg, streckad linje) och stegtid före och efter störning definierad som den tid som musen behöver för att övervinna ett hinder (obetingad stimulans; högre steg) som meddelas eller inte av en ton (betingad stimulus). (B) Protokollet består av fyra ostörda sessioner och fyra utmaningssessioner (en session/dag, 42 försök/session) som gör det möjligt att separat analysera finmotorisk inlärning (ostörd och endast CS i blått), utmanad motorisk inlärning (endast USA, i orange) och associativ motorisk inlärning (parad CS + US, i lila). Förkortningar: H = hög; L = låg; CS = betingad stimulans; US = obetingad stimulans. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Motorisk prestanda hos WT-möss under ostörda sessioner. (A) Vilotid i målburen (konstant, 15 s), tid för att reagera på signaler: ljus (konstant, 3 s) och luft (variabel); under dag 1-4 av ostörda sessioner. (B) Tid att gå över stegen efter signal (ljus och luft) under ostörda sessioner. C) Procentandel försök i varje ostörd session där djuret missade ett steg. En effektregressionsanalys användes för att studera inlärningsförloppet (R= 0,50: *p = 0,047, R= 0,90 ***p < 0,0001, respektive n = 4 möss). Förkortning: WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Prestanda för WT-möss under utmaningssessioner. Genomsnittlig tid på stegen efter ledtrådar under dag 5–8 för endast US-test (orange), parade (lila) och CS-only (ljusblå) försök. En icke-linjär regressionsanalys användes för att studera inlärningsförloppet (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n=4 möss). Tvåvägs RM ANOVA för att jämföra försökstyper (*p = 0,028, **p = 0,008, n = 4 möss, två hanar och två honor, medelvärde ± SEM). Förkortningar: CS = betingad stimulus; US = obetingad stimulans. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Förändringar i musstegsmönster under utmaningssessioner. (A) Procentandel försök per session där djuret missade ett steg under sessioner som endast är avsedda för USA och parningssessioner. En effektregressionsanalys användes för att studera inlärningsprocessen (*p = 0,013) och en tvåvägs RM ANOVA för jämförelse mellan försökstyper (*p = 0,032, n = 4 möss). (B) Stegtider före och efter störning i endast USA och parade sessioner under sessionerna. Tvåvägs upprepade mätningar ANOVA, *p < 0,05, n = 4 möss, två hanar och två honor, betyder ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur S1: Programvarugränssnitt: hur man skapar ett experiment och väljer ett protokoll. Skärmbilder från programvaran som illustrerar arbetsflödet som beskrivs i protokollsteg 2.1 och som omfattar steg 2.1.4 till 2.1.8. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Programvarugränssnitt: hur man startar sessionen och exporterar data. Skärmbilder från programvaran som illustrerar arbetsflödet som beskrivs i protokollsteg 2.2 och 2.5, som omfattar steg 2.2.4 till 2.2.7 och 2.5.1 till 2.5.3. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell S1: Statistiktabell. Beskrivning av alla variabler som studerats och de statistiska tester som tillämpats, rapporterade i figur 2B, C, figur 3 och figur 4A,B. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Erasmusstegen innebär stora fördelar för bedömning av motorfenotyper utöver de nuvarande metoderna. Testning är lätt att utföra, automatiserad, reproducerbar och gör det möjligt för forskare att bedöma olika aspekter av motoriskt beteende separat med hjälp av en enda muskohort. I den aktuella studien möjliggjorde reproducerbarheten generering av robusta data med ett litet antal WT-möss som drog nytta av enhetens egenskaper, experimentell design och analysmetoder. Till exempel, jämfört med traditionella strålgångsanalyser, ökar tillägget av motiverande signaler (luft och ljus) för att komma in i stegbanan och medvinden för att slutföra försöket konsistensen och hoppar över behovet av experimentatorns ingripande som är en stor källa till variabilitet.

Ett luftkompressorsystem krävs för att generera ett luftflöde som kan justeras till musens riktning och position. Luftflödet skapar en motvind på 30 km/h från motsatt håll när en mus försöker lämna målboxen innan den schemalagda provstarten, vilket gör att mössen återvänder till målboxen. Den genererar också en konstant medvind (1 till 16 km/h) under försöket tills musen helt korsar stegen och går in i den motsatta målrutan. Utan den trycksatta luften som ett incitament för att korsa stegen pausar möss ofta på stegpinnarna och byter riktning i lugn takt, vilket introducerar en utforskande variabel som är kontraproduktiv för analysen.

Standardprotokollet som beskrivs här ger mätningar av grundläggande finmotorisk koordination och inlärning (ostörda sessioner), samt av anpassning till utmaningar och associativ motorisk inlärning (utmaningssessioner) under en tidsperiod på 8 dagar. Uppgiften är enkel för WT-musstammar som vanligtvis används för neurovetenskapliga studier, såsom C57Bl6J-mössen som används här, och är säker, utan att några skador observeras i någon av testsessionerna. Dessutom upptäckte vi inga tecken på trötthet jämfört med andra motortester som rotarod eller löpband.

Under den inledande fasen på 4 dagar behärskar WT-möss färdigheten och korsar stegen genom att lära sig att anta det mest effektiva löpmönstret (H-H-steg) och felsteg inträffar sällan dag 4 (Figur 2B,C). På dag 5 i den andra fasen är mössen långsammare när de först stöter på hindret, men anpassar sig snabbt (figur 3, endast USA). Att koppla hindret med ett betingningsstimulus (tonus) underlättar inlärningen i den utsträckning att provets längd är lika med försök där hindret inte presenteras (Figur 3, parad). Värt att notera är att antalet studier med felsteg förblev konstant under alla studier som endast genomfördes i USA (Figur 4A), medan en signifikant minskning observerades i parsessioner (Figur 4A), vilket bekräftar effektiviteten i den associativa inlärningsprocessen.

Vi föreslår ett arbetsflöde för analys av representativa parametrar som tillhandahålls av programvaran Erasmus Ladder. Powerregressionsanalysen gjorde det möjligt för oss att registrera signifikanta inlärningskurvor och upptäcka skillnader i utmanad kontra associativ inlärning med hjälp av fyra WT-möss. Baserat på ytterligare litteratur och pilotexperiment kan experimentell design med muterade eller behandlade möss kräva att antalet möss ökas till 7-10 möss ^4,5,6. I våra händer var 42 försök per session ett optimalt antal för att få robusta data med en liten muskohort eftersom medelvärdet av flera studier minskar variabiliteten. Även om antalet kan tyckas högt, tar varje 42 försökssession mellan 15 minuter och 35 minuter, och 12-16 möss kan rimligen testas per dag. Provets längd (inklusive vilotid och respons på signaler plus tid för att korsa stegen) varierar mellan 20 s och 50 s, beroende på träningsdag och typ av test.

Systemets mångsidighet kommer dock att göra det möjligt för forskare att utforma skräddarsydda protokoll genom att justera olika inställningar, inklusive antalet sessioner och försök per dag, intensiteten och varaktigheten av ledtrådar och CS, samt USA:s natur. Till exempel visade våra data en snabb inlärningskurva hos WT-möss, särskilt mellan dag 1 och dag 2 efter att prestationen nått en platå (figur 2B,C). Detta tydde på att de ytterligare 2 dagarna kanske inte är absolut nödvändiga för att testa grundläggande motorisk inlärning i ostörda sessioner, och modifieringar av standardprotokollet kan implementeras genom att minska träningstiden till bara 2 dagar. Men den här anpassningen kanske inte är lämplig för den andra fasen av protokollet, som innehåller interfolierade ostörda, endast USA, endast CS och parade prövningar. Stimuli presenteras slumpmässigt och oväntat för att bedöma specifika beteenden, och behovet av att dela upp experimentella försök i dessa fyra kategorier gör 42 till ett lämpligt antal studier som krävs för statistisk styrka. En omorganisering av prövningsprotokollet skulle därför behöva bedöma om det är möjligt att minska antalet ostörda prövningar eller öka antalet prövningar med särskilda provokationer. Interstimulusintervallet (ISI) mellan CS (90 dB, 15 kHz ton) och US, här satt till 250 ms, kan också varieras för att studera stimulus-responsassociationen. Denna typ av justering skulle göra det möjligt för forskare att titrera svårighetsgraden eller fokusera på olika beteenden beroende på den vetenskapliga frågan.

Hittills har Erasmusstegen mest använts för att upptäcka subtila defekter i den motoriska koordinationen av cerebellärt ursprung. Till exempel är felsteg ett mått på hela kroppens motoriska koordination. I denna studie användes unga vuxna möss men möss så unga som P23 har använts av andra för att studera mognaden av rörelsefunktioner ^7,8. Ipsilaterala patologier av centralt ursprung kunde studeras genom diskriminerande analys av positionen för musens högra och vänstra tassar. Slutligen engagerar behärskning av motoriska färdigheter på Erasmusstegen sannolikt andra motoriska styrkretsar, som involverar de basala ganglierna, motoriska cortex och anslutande vägar, inklusive corpus callosum. Att kombinera detta beteendeparadigm med cellulära, molekylära och kretstekniker kommer att vara användbart för att undersöka kretsmekanismer som förmedlar motorisk anpassning och kan utnyttjas för att öka motorisk inlärning. Ett sådant exempel skulle vara att studera påverkan på axonal myelinisering, som är mycket känslig för förvärv av finmotorik i musmodeller av demyelinisering ^9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.