Katmanlı Ağar Montajı: Ters Mikroskopla Canlı Zebra Balığı Embriyolarını Uzun Süreli Görüntülemeye Hazırlama

Overview

Bu makalede, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, Inverted Microscope'ta görüntüleme için normal cam tabanlı mikroskopi tabakları kullanılarak uygun maliyetli ve kolay gerçekleştirilir. Montaj, farklı konsantrasyonlarda agarose katmanlarında gerçekleştirilir.

Protocol

1. Embriyoların hazırlanması

1. Çiftleşmeden sonra, E3'teki embriyoları bir Petri kabında hasat edin ve monte etmeden önce yaklaşık 28 saat boyunca 26,5 °C'de kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bu, embriyoların gelişimini yavaşlatır, böylece embriyolar görüntülemenin başlangıcında yaklaşık 30 somit aşamasındadır.
2. E3'te embriyoları %0.016-0.020 Trikainde uyuşturmak. Pigmentasyonu inhibe etmek için PTU'yu 200 μM konsantrasyona ekleyin.
3. Diseksiyon mikroskobu altında kümesps kullanarak embriyoları arındırın. İki toparlama kullanarak, embriyoyu serbest bırakmak için chorion'u tutun ve hafifçe çekin.

2. Agarose montaj

NOT: Geliştirilen montaj yöntemi, E3'te gerektiğinde % 0,02 Trikain ve PTU ile iki farklı konsantrasyonda düşük erimiş agarose gerektirir. İlk agarose çözeltisi, bozulma ve hareketliliğin minimumda olduğu optimal bir agarose konsantrasyonu içerir. Optimizasyon aşağıdaki 5.

1. İki katman için agarose çözeltilerini ısıtın (aşağıdaki 5. adımda tanımlanan konsantrasyon ve% 1) 65 °C'ye kadar. Agarose'un montajdan hemen önce yaklaşık 30 °C'ye kadar soğumasını bekleyin, böylece embriyo ısıdan zarar görmez. Montaj için 0 numaralı kapaklı cam alt kısmı olan 35 mm cam alt tabakları kullanın. Kabın dibine takılan kapak camı, embriyonun yerleştirileceği 10 mm sığ (yaklaşık 1,2 mm derinliğinde) bir kuyu oluşturur.
   NOT: Bu durumda, en az hareketlilik ve bozulmaya sahip konsantrasyon% 0.025 ila% 0.040 agarose arasındaydı.
2. Bir cam pipet veya mikropipette kullanarak, yan taraflarından biriyle kafeinsiz bir embriyoyu yemeğin dibine doğru hafifçe yerleştirin. Bir mikropipette kullanıyorsanız, embriyoya uyacak şekilde açıklığın boyutunu artırmak için ucun dış kısmını kesin (Şekil 1A). Kalan E3'leri bir mikropipette ile dikkatlice çıkarın.
3. Embriyoyu örtmek için kabın dibine tutturulmuş kapak camı tarafından oluşturulan küçük kuyuya ilk agarose çözeltisini ekleyin (Katman 1) (Şekil 1B). Agarose'un küçük kuyuyu kapladığından ancak taşmayacağından emin olun.
4. İki kapak camı arasındaki embriyo ile dar bir agaroz dolgulu alan oluşturmak için küçük kuyuyu bir kapak camı (22 mm x 22 mm) (Şekil 1C)ile örtün.
5. Kapağın üzerine kabın alt kısmına %1 agarose çözeltisi tabakası yerleştirin (Katman 2)(Şekil 1D). Bu tabaka katılaştıkça, kapak camını yerinde tutar.
6. Sistemi nemli tutmak için yemeğin kalan kısmını% 0,02 Trikain içeren E3 ile doldurun (Katman 3) (Şekil 1E).
   NOT: Bu kurulumda, kapak camı ve% 1 agarose alt tabakanın seyreltilmesini korur.

3. Katman 1 için agarose çözeltisinin optimizasyonu

1. Katman 1 için en uygun agarose konsantrasyonu tanımlamak için çok ölçekli bir ızgara arama yaklaşımı kullanın. Embriyoların % 0.01 ila% 1 arasında değişen artan agarose konsantrasyonlarında monte edilir ve ardından embriyo büyüme kısıtlaması ve görüş alanındaki hareketliliğin zaman atlamalı görüntülenmesi. Hem bozulmanın hem de hareketliliğin minimumda olduğu konsantrasyonları tanımlayın.
2. Agarose konsantrasyonu daha da optimize etmek için, embriyoları 3.1 adımında en iyi bulunan konsantrasyona bağlı olarak daha ince bir agarose konsantrasyonu (örneğin, % 0.025 ila% 0.040 agarose) kullanarak monte edin (örneğin, % 0.025, % 0.028, % 0.031, vb.).
   NOT: Laboratuvarımızda optimal agarose konsantrasyonu %0,03 civarındaydı.

Representative Results

Şekil 1 : Montaj yönteminin açıklaması. (A) Zebra balığı embriyosunu 35 mm'lik tabaktaki cam tabanın oluşturduğu küçük kuyuya ekleyin. (B) Embriyoyu örtmek için küçük kuyuya agarose tabakası 1 ekleyin. (C) Küçük kuyunun üzerine dikkatlice bir kapak camı yerleştirin. (D) 35 mm'lik kabın tüm altına agarose tabakası 2 ekleyin. (E) Yemeğe E3 ekleyin. (F) Montaj kurulumunun bir kesitinin şematik çizimi. (G) Son montajda zebra balığı embriyosunun mikroskop görüntüsü (5x amaç).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067