Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafisch-Embryonen für Langzeitaufnahmen mit einem invertierten Mikroskop

Overview

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um lebende Zebrafisch-Embryonen für die Langzeitbildgebung zu montieren. Diese Methode ist kostengünstig und einfach mit regulären Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf invertiertem Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Protocol

1. Zubereitung von Embryonen

1. Nach der Paarung Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 °C ca. 28 h vor der Montage bebrüten.
   HINWEIS: Dies verlangsamt die Entwicklung der Embryonen, so dass die Embryonen zu Beginn der Bildgebung etwa 30 Jahre alt sind.
2. Anästhetisieren Sie Embryonen in 0,016-0,020% Tricain in E3. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie PTU zu einer Konzentration von 200 M hinzu.
3. Dechorionate die Embryonen mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Mit zwei Zangen greifen und ziehen Sie den Chorion vorsichtig auseinander, um den Embryo freizusetzen.

2. Montage in Agarose

HINWEIS: Das entwickelte Montageverfahren erfordert zwei unterschiedliche Konzentrationen von Niedrigschmelz-Agarose in E3 mit 0,02% Tricain e und PTU bei Bedarf. Die erste Agaroselösung enthält eine optimale Konzentration von Agarose, bei der die Verzerrung und Beweglichkeit minimal sind. Die Optimierung wird in Schritt 5 unten beschrieben.

1. Erhitzen Sie die Agarose-Lösungen für die beiden Schichten (Konzentration definiert in Schritt 5 unten und 1%) bis 65 °C. Lassen Sie die Agarose kurz vor der Montage auf ca. 30 °C abkühlen, damit der Embryo durch die Hitze nicht geschädigt wird. Für die Montage verwenden Sie 35 mm Glasbodenschalen mit einem Abdeckungsboden Nr. 0. Das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas erzeugt einen 10 mm flachen (ca. 1,2 mm tiefen) Brunnen, in dem der Embryo platziert werden soll.
   HINWEIS: In diesem Fall lag die Konzentration mit der geringsten Beweglichkeit und Verzerrung zwischen 0,025 und 0,040% Agarose.
2. Legen Sie einen dechorionierten Embryo mit einer seiner Seiten mit einer Glaspipette oder Mikropipette vorsichtig zur Unterseite der Schale. Wenn Sie eine Mikropipette verwenden, schneiden Sie den äußeren Teil der Spitze, um die Größe der Öffnung zu erhöhen, um den Embryo zu passen (Abbildung 1A). Entfernen Sie alle verbleibenden E3 sorgfältig mit einer Mikropipette.
3. Fügen Sie die erste Agarose-Lösung zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas geschaffen wurde, um den Embryo zu bedecken (Schicht 1)(Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Agarose den kleinen Brunnen bedeckt, aber nicht überfließen wird.
4. Bedecken Sie den kleinen Brunnen mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm)(Abbildung 1C), um einen schmalen Agarose gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen.
5. Legen Sie eine Schicht von 1% Agarose Lösung auf der Oberseite des Deckglases auf der untere Seite der Schale (Schicht 2) (Abbildung 1D). Wenn diese Schicht verfestigt, hält sie das Deckglas an Ort und Stelle.
6. Füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3, das 0,02% Tricain enthält, um das System hydratisiert zu halten (Schicht 3) (Abbildung 1E).
   HINWEIS: In diesem Setup schützen das Deckglas und 1% Agarose die untere Schicht vor verdünntem.

3. Optimierung der Agarose-Lösung für Schicht 1

1. Um die optimale Konzentration von Agarose für Layer 1 zu identifizieren, verwenden Sie einen mehrskalen Rastersuchansatz. Mount-Embryonen in zunehmenden Konzentrationen von Agarose im Bereich von 0,01% bis 1%, gefolgt von Zeitraffer-Bildgebung von Embryo-Wachstumsbeschränkung und Beweglichkeit im Sichtfeld. Identifizieren Sie die Konzentrationen, bei denen sowohl die Verzerrung als auch die Beweglichkeit minimal sind.
2. Um die Konzentration von Agarose weiter zu optimieren, montieren Sie die Embryonen mit einem feineren Bereich von Agarosekonzentrationen (z. B. zwischen 0,025 und 0,040% Agarose), je nach der Konzentration, die in Schritt 3.1 am besten ist (z. B. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   HINWEIS: In unserem Labor lag die optimale Agarosekonzentration bei etwa 0,03%.

Representative Results

Abbildung 1: Beschreibung der Montagemethode. (A) Fügen Sie den Zebrafisch-Embryo zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch den Glasboden in der 35 mm Schale geschaffen wurde. (B) Fügen Sie der Agaroseschicht 1 den kleinen Brunnen hinzu, um den Embryo zu bedecken. (C) Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den kleinen Brunnen. (D) Agaroseschicht 2 auf den gesamten Boden der 35 mm Schale geben. (E) E3 zum Gericht hinzufügen. (F) Schematische Zeichnung eines Querschnitts der Montageeinrichtung. (G) Mikroskopbild (5x Objektiv) des Zebrafisch-Embryos in der Endmontage.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067