Overview
מאמר זה מתאר שיטה להרכבת עוברי זברה חיים להדמיה ארוכת טווח. שיטה זו חסכונית וקלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופיות רגילות עם תחתית זכוכית להדמיה במיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של agarose בריכוזים שונים.
Protocol
1. הכנת עוברים
- לאחר ההזדווגות, קוצרים עוברים ב- E3 בצלחת פטרי ומדגרים אותם ב-26°C למשך כ-28 שעות לפני ההרכבה.
שים לב: זה מאט את התפתחות העוברים כך שהעוברים נמצאים בערך בשלב 30 סומיט בתחילת ההדמיה. - יש למרדים עוברים ב-0.016-0.020% טריקאין ב-E3. כדי לעכב פיגמנטציה, להוסיף PTU לריכוז של 200 מיקרומטר.
- Dechorionate העוברים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ מנתח. באמצעות שני מלקחיים, אחיזה בעדינות למשוך את chorion לגזרים כדי לשחרר את העובר.
2. הרכבה ב agarose
שים לב: שיטת ההרכבה המפותחת דורשת שני ריכוזים שונים של אגרוז להמסה נמוכה ב- E3 עם 0.02% טריקאין ו- PTU לפי הצורך. הפתרון הראשון agarose מכיל ריכוז אופטימלי של agarose שבו עיוות תנועתיות הם לכל הפחות. המיטוב מתואר בשלב 5 להלן.
- מחממים את הפתרונות agarose עבור שתי שכבות (ריכוז מוגדר בשלב 5 מתחת ו 1%) ל 65 °C (65 °F). תן agarose להתקרר כ 30 מעלות צלזיוס רק לפני ההרכבה, כך העובר אינו נפגע על ידי החום. להרכבה, יש להשתמש בכלים תחתונים מזכוכית 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מס' 0. זכוכית הכיסוי המחוברת לתחתית המנה יוצרת באר רדודה של 10 מ"מ (בעומק של כ-1.2 מ"מ), בה יש למקם את העובר.
שים לב: במקרה זה, הריכוז עם תנועתיות ועיוותים לפחות היו בין 0.025 ל 0.040% agarose. - מניחים בעדינות עובר dechorionated עם אחד הצדדים הצדדיים שלה לכיוון החלק התחתון של המנה באמצעות פיפטה זכוכית או micropipette. אם אתם משתמשים במיקרופיפט, חתכו את החלק החיצוני של הקצה כדי להגדיל את גודל הפתח כך שיתאים לעובר (איור 1A). הסר בזהירות את כל E3 הנותרים עם מיקרופיפט.
- הוסיפו את פתרון ההתעוררות הראשון לבאר הקטנה שנוצרה על ידי זכוכית הכיסוי המחוברת לתחתית המנה כדי לכסות את העובר (שכבה 1)(איור 1B). ודא כי agarose מכסה את הבאר הקטנה אבל לא יעלה על גדותיו.
- כסו את הבאר הקטנה בזכוכית כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ)(איור 1C)ליצירת חלל צר ומלא בעובר שבין שתי כוסות הכיסוי.
- מניחים שכבה של 1% פתרון agarose על גבי הכיסוי בכל רחבי החלק התחתון של המנה (שכבה 2) (איור 1D). כאשר שכבה זו מתגבשת, היא מחזיקה את זכוכית הכיסוי במקומה.
- מלאו את החלק הנותר של המנה ב-E3 המכיל 0.02% טריקאין כדי לשמור על המערכת לחה (שכבה 3)(איור 1E).
שים לב: בהגדרה זו, זכוכית הכיסוי ו 1% agarose להגן על השכבה התחתונה מלהיות מדולל.
3. אופטימיזציה של פתרון agarose לשכבה 1
- כדי לזהות את הריכוז האופטימלי של agarose עבור שכבה 1, השתמש בגישת חיפוש רשת רב-גוונית. הר עוברים בריכוזים הולכים וגדלים של agarose החל 0.01% כדי 1% ואחריו הדמיה לשגות בזמן של הגבלת צמיחת העובר ותנועתיות בתחום הראייה. זהה את הריכוזים שבהם גם העיוות וגם תנועתיות הם לכל הפחות.
- כדי לייעל את הריכוז של agarose עוד יותר, לעלות על העוברים באמצעות טווח עדין יותר של ריכוזים של agarose (למשל, בין 0.025 ו 0.040% agarose) בהתאם לריכוז נמצא להיות הטוב ביותר בשלב 3.1 (למשל, 0.025%, 0.028%, 0.031%, וכו ').
שים לב: במעבדה שלנו, ריכוז האגורוז האופטימלי היה סביב 0.03%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 : תיאור שיטת ההרכבה. (א) מוסיפים את עובר הזברה לבאר הקטנה שנוצרה על ידי תחתית הזכוכית בצלחת 35 מ"מ. (B) מוסיפים שכבה 1 לבאר הקטנה כדי לכסות את העובר. (ג) מניחים בזהירות כיסוי מעל הבאר הקטנה. (ד) מוסיפים שכבת אגרוז 2 על כל החלק התחתון של צלחת 35 מ"מ. (ה) מוסיפים E3 למנה. (ו) ציור סכמטי של חתך רוחב של הגדרת ההרכבה. (ז) תמונת מיקרוסקופ (מטרה 5x) של עובר הזברה במונטאז' הסופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 |
