स्तरित एगर माउंटिंग: एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए लाइव ज़ेब्राफिश भ्रूण तैयार करना

Abstract

स्रोत: उपाध्याय एस, et.al। पूरे ज़ेब्राफिश भ्रूण के विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि। जे विस एक्सप्रेस। (2020).

यह लेख लंबी अवधि इमेजिंग के लिए लाइव जेब्राफिश भ्रूण माउंट करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह विधि लागत प्रभावी और उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए नियमित ग्लास-बॉटम माइक्रोस्कोपी व्यंजनों का उपयोग करके प्रदर्शन करने में आसान है। बढ़ते विभिन्न सांद्रता पर agarose की परतों में किया जाता है।

Protocol

1. भ्रूण की तैयारी

1. संभोग के बाद, एक पेट्री डिश में E3 में फसल भ्रूण और उन्हें बढ़ते से पहले के बारे में 28 घंटे के लिए 26.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
   नोट: यह भ्रूण के विकास को धीमा कर देता है ताकि भ्रूण इमेजिंग की शुरुआत में लगभग 30 सोमाइट चरण में हों।
2. E3 में 0.016-0.020% ट्राइकेन में भ्रूण एनेस्थेटाइज करें। पिगमेंटेशन को बाधित करने के लिए, पीटीयू को 200 माइक्रोन की एकाग्रता में जोड़ें।
3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश का उपयोग करके भ्रूण को डिकोरोनेट करें। दो संदंश का उपयोग करना, पकड़ और धीरे से भ्रूण को रिहा करने के लिए अलग chorion खींचो ।

2. एगरे में बढ़ते

नोट: विकसित बढ़ते विधि के लिए ई3 में 0.02% ट्राइकेन और पीटीयू की आवश्यकता के साथ कम पिघलने वाली एगरेज़ की दो अलग-अलग सांद्रता की आवश्यकता होती है। पहले एगर उठे समाधान में एगर उठे की एक इष्टतम एकाग्रता होती है जिस पर विरूपण और गतिशीलता कम से कम होती है। अनुकूलन नीचे चरण 5 में वर्णित है।

1. दो परतों के लिए एगर उठे समाधानों को गर्म करें (नीचे चरण 5 में परिभाषित एकाग्रता और 1%) 65 डिग्री सेल्सियस तक। बढ़ते से ठीक पहले एगरे को लगभग 30 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें ताकि भ्रूण को गर्मी से नुकसान न हो। बढ़ते के लिए, नंबर 0 कवर ग्लास बॉटम के साथ 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजन का उपयोग करें। डिश के नीचे से जुड़ा कवर ग्लास 10 एमएम उथले (लगभग 1.2 मिमी गहरा) अच्छी तरह से बनाता है, जिसमें भ्रूण रखा जाना है।
   नोट: इस मामले में, सबसे कम गतिशीलता और विकृतियों के साथ एकाग्रता 0.025 से 0.040% के बीच थी।
2. धीरे-धीरे एक ग्लास पिपेट या माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पकवान के नीचे की ओर अपने पार्श्व पक्षों में से एक के साथ एक डिकेरोनेट भ्रूण रखें। यदि माइक्रोपिपेट का उपयोग कर रहे हैं, तो भ्रूण(चित्रा 1A)को फिट करने के लिए खोलने के आकार को बढ़ाने के लिए टिप के बाहरी हिस्से को काट दें। किसी भी शेष E3 को माइक्रोपिपेट के साथ सावधानी से हटा दें।
3. भ्रूण (परत 1)(चित्रा 1B)को कवर करने के लिए डिश के नीचे से जुड़े कवर ग्लास द्वारा बनाई गई छोटी अच्छी तरह से पहले एगर उठे समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि agarose छोटे कुएं को कवर करता है, लेकिन यह अतिप्रवाह नहीं होगा ।
4. दो कवर चश्मे के बीच भ्रूण के साथ एक संकीर्ण एग्रामस भरे स्थान बनाने के लिए एक कवर ग्लास (22 मिमी x 22 मिमी)(चित्रा 1C)के साथ छोटे कुएं को कवर करें।
5. डिश (लेयर 2)(चित्रा 1D)के नीचे कवर ग्लास के शीर्ष पर 1% एगर उठे समाधान की एक परत रखें। जैसे ही यह परत जमती है, यह कवर ग्लास को जगह में रखती है।
6. सिस्टम को हाइड्रेटेड (लेयर 3)(चित्रा 1E)रखने के लिए 0.02% ट्राइकेन युक्त ई 3 के साथ डिश के शेष हिस्से को भरें।
   नोट: इस सेटअप में, कवर ग्लास और 1% एगर उठे नीचे की परत को पतला होने से बचाते हैं।

3. लेयर 1 के लिए एगरेग्यास सॉल्यूशन का ऑप्टिमाइज़ेशन

1. लेयर 1 के लिए एगर उठे की इष्टतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए, मल्टीस्केल ग्रिड खोज दृष्टिकोण का उपयोग करें। 0.01% से 1% तक की सांद्रता बढ़ाने में माउंट भ्रूण भ्रूण विकास प्रतिबंध और देखने के क्षेत्र में गतिशीलता के समय चूक इमेजिंग के बाद। सांद्रता की पहचान करें जहां विरूपण और गतिशीलता दोनों कम से कम हैं।
2. आगे उठने की एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए, चरण 3.1 (जैसे, 0.025%, 0.031%, आदि) में सबसे अच्छा पाए जाने वाले एकाग्रता के आधार पर एगर उठी (उदाहरण के लिए, 0.025% के बीच, एगर उठी की सांद्रता की एक महीन रेंज का उपयोग करके भ्रूण को माउंट करें)।
   नोट: हमारी प्रयोगशाला में, इष्टतम एगरेग्या एकाग्रता लगभग 0.03% थी।

Results

चित्रा 1: बढ़ते विधि का विवरण। (क) 35 एमएम डिश में ग्लास बॉटम द्वारा बनाए गए छोटे कुएं में जेब्राफिश भ्रूण डालें। (ख) भ्रूण को ढकने के लिए छोटे कुएं में एगरेग्यर 1 डालें । (ग) ध्यान से छोटे कुएं के ऊपर एक कवर ग्लास रखें । (घ) 35 मिमी डिश के पूरे तल पर एगरेयर 2 जोड़ें। (ङ) डिश में E3 जोड़ें । (च) बढ़ते हुए सेट अप के क्रॉस सेक्शन की योजनाबद्ध ड्राइंग । (जी) अंतिम असेंबल में जेब्राफिश भ्रूण की माइक्रोस्कोप इमेज (5x ऑब्जेक्टि...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm  	VWR	48366 067