Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- E3 ortamında embriyo içeren bir Petri kabı ile başlayın. Embriyoları uyuşturmak için trikain ekleyin ve pigment oluşumunu engellemek için fenilthiouria, PTU çözeltisi.
Kafeinsiz embriyolardan birini merkezde sığ bir cam tabana sahip küçük bir Petri kabına aktarmak için bir cam pipet kullanın ve fazla ortamı çıkarın. Daha sonra, embriyo bozulmasını ve hareketliliğini en aza indirmek için bir agarose çözeltisini bir mikrofuge tüpüne yerleştirin ve ısıtın. Isı nedeniyle embriyoya zarar vermemek için sıcaklığı 30 santigrat dereceye getirin.
Agarose'un ilk tabakasını embriyonun üzerine dökün, sığ kuyuyu tamamen doldurun. Kuyunun üzerine başka bir kapak camı yerleştirin ve bunun üzerine% 1 agarose ekleyin. İkinci katman kapak camını yerinde tutar.
Agarose katılaştıktan sonra, Petri kabını trikain içeren E3 ortamı ile doldurun. Bu üçüncü katmandır ve agarose ve embriyoyu nemli tutar. Aşağıdaki protokolde, zebra balığı embriyolarının katmanlı agar montajını uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme için gerçekleştireceğiz.
- Montajdan hemen önce, agarose çözeltisini 65 santigrat dereceye ısıtın ve daha sonra embriyonun ısıdan zarar görmemesi için yaklaşık 30 santigrat derece soğumaya bırakın ve agarose çözeltisine trikain ekleyin. Sıfır numaralı kapalı cam alt kısmı olan 35 milimetre cam alt tabaklar kullanın. Yan taraflarından biriyle kafeinsiz bir embriyoyu bir cam pipet veya mikropipette ile yemeğin dibine doğru hafifçe yerleştirin.
Ekle Ilk agarose Çözüm Hedef Küçük peki, ben de seni Oluşturulan Tarafından Kapak Cam Bağlı Hedef Alt hakkında Çanak Hedef Kapak Embriyo Yapma Emin bu agarose Kapsar Küçük peki, ben de seni Ama yapar Değil Taşma Evet, bu. Kapak Küçük peki, ben de seni Ile Kapak Cam Hedef Oluşturmak A Dar agarose dolu Alanı Ile Embriyo Arasında İki Kapak Gözlük. Yer A Katman hakkında 1% agarose Çözüm -ını Sayfanın Üstü hakkında Kapak Cam Tüm Üzerinde Alt hakkında Çanak hangi irade Tutmak Kapak Cam Inç Yer Olarak bu Katılaşır. Sonra Doldurmak Kalan Bölümü hakkında Çanak Ile E3 Içeren 0.02% trikain Hedef Tutmak Sistem Sulu. Hedef Tanımlamak En iyi agarose Konsantrasyon Için Katman Bir Mount Embriyo Inç Artan Konsantrasyon hakkında agarose Ve Gerçekleştirmek Timelapse Görüntüleme Hedef Tanımlamak Konsantrasyon bu En aza indirir Embriyo Bozulma Ve Motilite Sonra Test A Ince Aralığı hakkında Konsantrasyon Temel -ını Sonuç -ları.
- Bu protokolün en kritik adımı, birinci katman için en uygun agarose konsantrasyonunun belirlenmesidir. En uygun konsantrasyonu bulmak için% 0.030, % 0.032 ve benzeri farklı nano agarose konsantrasyonlarını test edin.
