Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafisch-Embryonen für Langzeitaufnahmen mit einem invertierten Mikroskop

- Beginnen Sie mit einer Petrischale, die Embryonen in E3-Medium enthält. Fügen Sie Tricain zur Anästhesisierung der Embryonen und Phenylthiouria, PTU-Lösung, hinzu, um die Pigmentbildung zu hemmen.

Verwenden Sie eine Glaspipette, um einen der dechorionierten Embryonen auf eine kleine Petrischale mit einem flachen Glasboden gut in der Mitte zu übertragen und das überschüssige Medium zu entfernen. Als nächstes legen Sie eine Agarose-Lösung in einer optimalen Konzentration, um embryonale Verzerrung und Beweglichkeit in ein Mikrofugenrohr zu minimieren und zu erhitzen. Bringen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius herunter, um eine Schädigung des Embryos durch Hitze zu vermeiden.

Gießen Sie die erste Schicht von Agarose über den Embryo, vollständig füllen den flachen Brunnen. Legen Sie ein weiteres Deckglas über den Brunnen und fügen Sie 1% Agarose darüber. Die zweite Schicht hält das Deckglas an Ort und Stelle.

Sobald die Agarose erstarrt, füllen Sie die Petrischale mit dem E3-Medium, das Tricain enthält. Dies ist die dritte Schicht und hält die Agarose und den Embryo hydratisiert. Im folgenden Protokoll führen wir geschichtete Agar-Montage von Zebrafisch-Embryonen für längere Zeitraffer-Bildgebung durch.

- Kurz vor der Montage, Erhitzen Sie die Agarose-Lösung auf 65 Grad Celsius und lassen Sie sie dann auf ca. 30 Grad Celsius abkühlen, damit der Embryo nicht durch die Hitze geschädigt wird, und fügen Sie der Agarose-Lösung Tricain hinzu. Verwenden Sie 35 Millimeter Glasbodenschalen mit einer Nummer Null bedeckten Glasboden. Legen Sie vorsichtig einen dechorionierten Embryo mit einer seiner seitlichen Seiten zum Boden der Schale mit einer Glaspipette oder einer Mikropipette. Dann entfernen Sie vorsichtig jede verbleibende E3 mit einer Mikropipette.

Hinzufügen das Ersten Agarose Lösung An das klein Gut Erstellt Von das Cover Glas Angefügt An das Unteres von das Gericht An Cover das Embryo Machen Sicher das das Agarose Deckt das klein Gut Aber tut Nicht Überlauf Es. Cover das klein Gut Mit das Cover Glas An Erstellen Eine Schmalen agarose-gefüllt Raum Mit das Embryo Zwischen das Zwei Cover Gläser. Ort Eine Schicht von 1% Agarose Lösung Auf Nach oben von das Cover Glas Alle Über das Unteres von das Gericht welche Wird Halten das Cover Glas In Ort Als Es Erstarrt. Dann Füllen das verbleibend Teil von das Gericht Mit E3 Mit 0.02% tricaine An Halten das System Hydratisiert. An Identifizieren das Optimale Agarose Konzentration Für Schicht Eins Mount das Embryonen In Erhöhung Konzentrationen von Agarose Und Ausführen Zeitraffer Imaging An Identifizieren das Konzentration das Minimiert Embryo Verzerrung Und Motilität Dann Test Eine Feiner Bereich von Konzentrationen Basierend Auf das Ergebnisse.

- Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist die Identifizierung der optimalen Konzentration von Agarose für Schicht eins. Testen Sie verschiedene Nanokonzentrationen von Agarose wie 0,030%, 0,032% et cetera, um die optimale Konzentration zu finden.