Montagem de Ágar em camadas: preparando embriões de zebrafish vivos para imagens de longo prazo com um microscópio invertido

Overview

Este artigo descreve um método para montar embriões de zebrafish vivos para imagens de longo prazo. Este método é econômico e fácil de executar usando pratos regulares de microscopia de fundo de vidro para imagens no Microscópio Invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Protocol

1. Preparação de embriões

1. Após o acasalamento, colmeia embriões em E3 em uma placa de Petri e incuba-os a 26,5 °C por cerca de 28 h antes de montar.
   NOTA: Isso retarda o desenvolvimento dos embriões para que os embriões estejam aproximadamente em 30 estágios de somite no início da imagem.
2. Embriões anestesiadores em 0,016-0,020% Tricaine na E3. Para inibir a pigmentação, adicione PTU a uma concentração de 200 μM.
3. Descorionato os embriões usando fórceps sob um microscópio dissecando. Usando dois fórceps, segure e puxe suavemente o acorde para liberar o embrião.

2. Montagem em agarose

NOTA: O método de montagem desenvolvido requer duas concentrações diferentes de agarose de baixo derretimento na E3 com 0,02% tricaine e PTU conforme necessário. A primeira solução de ágarose contém uma concentração ideal de agarose em que a distorção e a motilidade estão no mínimo. A otimização é descrita na etapa 5 abaixo.

1. Aqueça as soluções de ágarose para as duas camadas (concentração definida na etapa 5 abaixo e 1%) a 65 °C. Deixe a agarose esfriar até aproximadamente 30 °C pouco antes da montagem para que o embrião não seja prejudicado pelo calor. Para montagem, use pratos de fundo de vidro de 35 mm com um fundo de vidro de cobertura nº 0. O vidro de cobertura preso à parte inferior do prato cria um poço raso de 10 mm (aproximadamente 1,2 mm de profundidade), no qual o embrião deve ser colocado.
   NOTA: Neste caso, a concentração com menor motilidade e distorções ficou entre 0,025 e 0,040%.
2. Coloque suavemente um embrião descorioado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato usando uma pipeta de vidro ou micropipette. Se usar uma micropipette, corte a parte externa da ponta para aumentar o tamanho da abertura para caber no embrião(Figura 1A). Remova cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette.
3. Adicione a primeira solução de agarose ao pequeno poço criado pelo vidro de cobertura preso à parte inferior do prato para cobrir o embrião (Camada 1)(Figura 1B). Certifique-se de que a ágarose cobre o poço pequeno, mas não vai transbordar.
4. Cubra o pequeno poço com um copo de tampa (22 mm x 22 mm)(Figura 1C) para criar um espaço estreito de agarose preenchido com o embrião entre os dois óculos de cobertura.
5. Coloque uma camada de solução de 1% de agarose em cima do vidro de cobertura por toda a parte inferior do prato (Camada 2) (Figura 1D). À medida que esta camada se solidifica, ela mantém o vidro de cobertura no lugar.
6. Encha a porção restante do prato com E3 contendo 0,02% de Tricaine para manter o sistema hidratado (Camada 3) (Figura 1E).
   NOTA: Nesta configuração, o vidro de cobertura e 1% de agarose protegem a camada inferior de ser diluída.

3. Otimização da solução agarose para a camada 1

1. Para identificar a concentração ideal de agarose para a Camada 1, use uma abordagem de pesquisa de grade multiescala. Monte embriões em concentrações crescentes de agarose variando de 0,01% a 1% seguido por imagens de lapso de tempo de restrição de crescimento de embriões e motilidade no campo de visão. Identifique as concentrações onde tanto a distorção quanto a motilidade estão no mínimo.
2. Para otimizar ainda mais a concentração de agarose, monte os embriões utilizando uma faixa mais fina de concentrações de agarose (por exemplo, entre 0,025 e 0,040% agarose) dependendo da concentração encontrada como melhor na etapa 3.1 (por exemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   NOTA: Em nosso laboratório, a concentração ideal de agarose foi de cerca de 0,03%.

Representative Results

Figura 1 : Descrição do método de montagem. (A) Adicione o embrião de zebrafish ao pequeno poço criado pelo fundo de vidro no prato de 35 mm. (B) Adicione a camada 1 à pequena poço para cobrir o embrião. (C) Coloque cuidadosamente um vidro de cobertura sobre o poço pequeno. (D) Adicione a camada agarose 2 em todo o fundo do prato de 35 mm. (E) Adicione E3 ao prato. (F) Desenho esquemático de uma seção transversal da montagem configurada. (G) Imagem do microscópio (5x objetivo) do embrião de zebrafish na montagem final.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067