Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Comece com uma placa de Petri contendo embriões em meio E3. Adicione tricaine para anestesiar os embriões e fenilhiouria, solução PTU, para inibir a formação de pigmentos. Com a ajuda de um microscópio dissecando, descoriorar os embriões.
Use uma pipeta de vidro para transferir um dos embriões descolados para uma pequena placa de Petri com um fundo de vidro raso bem no centro e remova o meio de excesso. Em seguida, coloque uma solução de agarose em uma concentração ideal para minimizar a distorção e a motilidade do embrião em um tubo de microfuge e aqueça-o. Abaixe a temperatura para 30 graus Celsius para evitar danificar o embrião devido ao calor.
Despeje a primeira camada de agarose sobre o embrião, preenchendo completamente o poço raso. Coloque outro vidro de cobertura sobre o poço e adicione 1% de agarose em cima disso.
Uma vez que a agarose solidifique, encha a placa de Petri com o meio E3 contendo tricaine. Esta é a terceira camada e mantém a agarose e o embrião hidratados. No protocolo a seguir, realizaremos a montagem em camadas de embriões de zebrafish para imagens de lapso de tempo estendido.
- Pouco antes da montagem, aqueça a solução agarose a 65 graus Celsius e deixe esfriar a aproximadamente 30 graus Celsius para que o embrião não seja prejudicado pelo calor e adicione tricaine à solução agarose. Use pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com um fundo de vidro coberto número zero. Coloque delicadamente um embrião descorioado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato com uma pipeta de vidro ou uma micropipette. Em seguida, remova cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette.
adicionar o primeiro agarose solução Para o pequeno poço Criado por o cobrir vidro anexo Para o fundo de o prato Para cobrir o embrião Fazer certo Isso o agarose Cobre o pequeno poço mas faz não transbordar ela. cobrir o pequeno poço com o cobrir vidro Para criar um estreito agarose-preenchido espaço com o embrião entre o Dois cobrir óculos. lugar um camada de 1% agarose solução em Início de o cobrir vidro todo sobre o fundo de o prato qual vontade guardar o cobrir vidro em lugar como ela Solidifica. então encher o remanescente porção de o prato com E3 Contendo 0.02% tricaine Para guardar o sistema hidratado. Para identificar o óptimo agarose concentração durante camada Um montar o Embriões em Aumentar Concentrações de agarose e executar timelapse imagiologia Para identificar o concentração Isso Minimiza embrião distorção e motilidade então teste um Melhor gama de Concentrações baseado em o Resultados.
- O passo mais crítico deste protocolo é identificar a concentração ideal de agarose para a camada um. Teste diferentes nano concentrações de agarose tais como 0,030%, 0,032%, etc.
