Skiktad agarmontering: Förbereda levande zebrafiskembryon för långsiktig avbildning med inverterat mikroskop

Overview

Denna artikel beskriver en metod för att montera levande zebrafisk embryon för långsiktig avbildning. Denna metod är kostnadseffektiv och lätt att utföra med vanliga mikroskopifat med glasbotten för avbildning på inverterat mikroskop. Monteringen utförs i lager av agarose vid olika koncentrationer.

Protocol

1. Beredning av embryon

1. Efter parning, skörda embryon i E3 i en petriskål och inkubera dem vid 26,5 °C i ca 28 timmar före montering.
   OBS: Detta bromsar utvecklingen av embryona så att embryona är ungefär i 30 somitstadium i början av avbildningen.
2. Söv embryon i 0,016-0,020% Tricaine i E3. För att hämma pigmentering, tillsätt PTU till en koncentration av 200 μM.
3. Dechorionate embryona med hjälp av tång under ett dissekerande mikroskop. Använd två tångar, greppa och dra försiktigt isär korgen för att frigöra embryot.

2. Montering i agarose

OBS: Den utvecklade monteringsmetoden kräver två olika koncentrationer av lågsmält agarosa i E3 med 0,02% Tricaine och PTU efter behov. Den första agarosalösningen innehåller en optimal koncentration av agarosa där förvrängningen och motiliteten är minst. Optimeringen beskrivs i steg 5 nedan.

1. Värm agaroslösningarna för de två skikten (koncentration definierad i steg 5 nedan och 1%) till 65 °C. Låt agarosen svalna till ca 30 °C strax före montering så att embryot inte skadas av värmen. För montering, använd 35 mm glasbottenfat med en nr 0 täckglasbotten. Täckglaset som fästs på botten av skålen skapar en 10 mm grund (ca 1,2 mm djup) brunn, där embryot ska placeras.
   OBS: I detta fall var koncentrationen med minst motilitet och snedvridning mellan 0,025 och 0,040% agarose.
2. Placera försiktigt ett decilerat embryo med en av dess sidosidor mot botten av skålen med en glaspipett eller mikropipett. Om du använder en mikropipett, skär den yttre delen av spetsen för att öka öppningens storlek för att passa embryot (Figur 1A). Ta försiktigt bort eventuell kvarvarande E3 med en mikropipett.
3. Tillsätt den första agarosalösningen till den lilla brunn som skapas av täckglaset fäst på botten av skålen för att täcka embryot (skikt 1) (Figur 1B). Se till att agarosen täcker den lilla brunnen men inte kommer att översvämma den.
4. Täck den lilla brunnen med ett täckglas (22 mm x 22 mm) (Figur 1C) för att skapa ett smalt agarosafyllt utrymme med embryot mellan de två täckglasen.
5. Placera ett lager av 1% agaroselösning ovanpå täckglaset över botten av skålen (Lager 2) (Figur 1D). När detta lager stelnat håller det täckglaset på plats.
6. Fyll den återstående delen av skålen med E3 som innehåller 0,02 % trikain för att hålla systemet hydratiserat (lager 3) (figur 1E).
   OBS: I denna inställning skyddar täckglaset och 1% agaros bottenskiktet från att spädas ut.

3. Optimering av agaroselösning för lager 1

1. Om du vill identifiera den optimala koncentrationen av agarose för lager 1 använder du en flerskalad rutnätssökningsmetod. Mount embryon i ökande koncentrationer av agarose som sträcker sig från 0,01% till 1% följt av time-lapse imaging av embryo tillväxt begränsning och motility inom synfältet. Identifiera de koncentrationer där både förvrängningen och motiliteten är minst.
2. För att optimera koncentrationen av agarose ytterligare, montera embryona med ett finare intervall av koncentrationer av agarose (t.ex. mellan 0,025 och 0,040% agarose) beroende på den koncentration som befunnits vara bäst i steg 3.1 (t.ex. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   OBS: I vårt laboratorium var den optimala agarose koncentrationen cirka 0,03%.

Representative Results

Figur 1 : Beskrivning av monteringsmetoden. A) Tillsätt zebrafiskembryon till den lilla brunn som skapas av glasbotten i 35 mm-skålen. B) Tillsätt agarosskikt 1 till den lilla brunnen för att täcka embryot. C) Placera försiktigt ett täckglas över den lilla brunnen. (D) Tillsätt agarosskikt 2 på hela botten av 35 mm-skålen. (E) Tillsätt E3 i skålen. F) Schematisk ritning av ett tvärsnitt av monteringsuppsättningen. G) Mikroskopbild (5x mål) av zebrafiskembryon i det slutliga montaget.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067