Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Börja med en petriskål som innehåller embryon i E3 medium. Tillsätt trikain för att bedöva embryona och fenylthiouria, PTU-lösningen, för att hämma pigmentbildningen.
Använd en glaspipett för att överföra ett av de dechorionerade embryona till en liten Petri-skål med en grund glasbottenbrunn i mitten och ta bort överskottsmediet. Därefter placera en agarosalösning vid optimal koncentration för att minimera embryoförvrängning och motilitet i ett mikrofugerör och värm upp det. Ta ner temperaturen till 30 grader Celsius för att undvika att skada embryot på grund av värme.
Häll det första lagret av agarosa över embryot, fyll helt den grunda brunnen. Placera ett annat täckglas över brunnen och tillsätt 1% agarose ovanpå det. Det andra lagret håller täckglaset på plats.
När agarosen stelnat, fyll Petri-skålen med E3-mediet som innehåller trikain. Detta är det tredje lagret och håller agarosen och embryot hydratiserat. I följande protokoll kommer vi att utföra skiktad agarmontering av zebrafiskembryon för förlängd tidsfördröjningsavbildning.
- Strax före montering, värm agaroslösningen till 65 grader Celsius och låt den sedan svalna till cirka 30 grader Celsius så att embryot inte skadas av värmen och tillsätt trikain till agaroslösningen. Använd 35 millimeters glasbottenfat med ett nummer noll täckt glasbotten. Placera försiktigt ett decilorerat embryo med en av dess sidosidor mot botten av skålen med en glaspipett eller en mikropipett.
Add den Första agarose (agarose) Lösning Att den Liten Väl Skapad Av den Täcka Glas Kopplade Att den Botten Av den Maträtt Att Täcka den Embryo Gör Säker Att den agarose (agarose) Täcker den Liten Väl Men Gör Inte Overflow Det. Täcka den Liten Väl Med den Täcka Glas Att Skapa A Smala agarose-fylld Utrymme Med den Embryo Mellan den två Täcka Glasögon. Plats A Lager Av 1% agarose (agarose) Lösning På Topp Av den Täcka Glas Alla Över den Botten Av den Maträtt Som Kommer Hålla den Täcka Glas I Plats Som Det Stelnar. Sedan Fylla den Återstående Del Av den Maträtt Med E3 Innehållande 0.02% trikain Att Hålla den System Hydrerad. Att Identifiera den Optimal agarose (agarose) Koncentration För Lager ett Mount den Embryon I Öka Koncentrationer Av agarose (agarose) Och Utföra Timelapse Imaging Att Identifiera den Koncentration Att Minimerar Embryo Snedvridning Och Motilitet Sedan Test A Finare Utbud Av Koncentrationer Baserat På den Resultat.
- Det mest kritiska steget i detta protokoll är att identifiera den optimala koncentrationen av agarosa för lager ett. Testa olika nanokoncentrationer av agaros som 0,030%, 0,032%, etc. för att hitta den optimala koncentrationen.
