Electrofisiología de abrazadera de parches integrales: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Overview

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de abrazadera de parches de células enteras, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas Mauthner y otras células reticulostinas en embriones de pez cebra.

Protocol

1. Grabación de abrazadera de parches (modo celda completa)

1. Todas las grabaciones se realizan en todo el modo de abrazadera de parches de celda. Las cámaras de grabación se colocan en una etapa de microscopio en una configuración de electrofisiología. Nuestras etapas son fijas y el microscopio de abrazadera de parche vertical está atornillado a una plataforma de microscopio móvil o a un traductor de microscopio.
2. Las pipetas de abrazadera de parches se extrae en un tirador horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de vidrio borosilicato de paredes delgadas obtenido de WPI. Los diámetros de la punta de la pipeta están en el orden de 0.2-0.4 μm después del pulido del fuego a un borde liso, y la cónico del vástago es ~ 4 mm de longitud.
3. Conecte la pipeta a la etapa de la cabeza del amplificador en la configuración de electrofisiología. Es importante mantener la etapa de la cabeza en aproximadamente 45° de ángulo al eje horizontal, ya que esto asegura un ángulo de entrada para la pipeta que es adecuado para la formación de sellos de alta resistencia en la célula Mauthner.
4. Justo antes de entrar en la solución de baño, aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir la posibilidad de ensuciar la punta. Al registrar mEPSC, las soluciones de baño incluyen 1 μM TTX para bloquear los potenciales de acción, 5 μM de estricnina para bloquear los receptores de glicina y 10 μM de bicucullina o 100 μM de picrotoxina para bloquear los receptores GABAA. Al registrar mIPSC, las soluciones de baño incluyen 1 μM TTX, ácido kynurenic y bicucullina o estricnina dependiendo de la actividad del receptor de interés.
5. Acérquese a la célula M con una pequeña cantidad de presión positiva en la pipeta. La presión positiva empuja suavemente la célula de lado a lado y cuando se coloca inmediatamente sobre la célula, forma un pequeño hoyuelo en la membrana celular. Deje la pipeta en su lugar durante unos segundos para limpiar suavemente la superficie celular para que se pueda formar un sello fuerte entre la pipeta y la membrana. Liberar la presión positiva en la pipeta permite iniciar el sello y una pequeña cantidad de presión negativa junto con potenciales negativos de pipeta da como resultado que los sellos GigaΩ se formen en pocos segundos.
6. Cambie el potencial de retención del amplificador a -60 mV. Romper la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión. Registre inmediatamente los potenciales de membrana y minimice los artefactos de capacitancia. Compense la capacitancia celular (Cm) y la resistencia de acceso (serie) (Ra) en un 70-85%. Ra debe ser monitoreado rutinariamente, cada 30 segundos a un minuto, y si hay un cambio de 20% o más, abortar el experimento.
7. Una vez finalizado el experimento y se han adquirido suficientes datos, la preparación se sacrifica quitando el freno trasero con un par de fórceps. En este punto, el análisis de datos puede comenzar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette Puller	Sutter Instruments Co	P-97
Upright Patch clamp microscope	Leica Microsystems	DMLFSA
Amplifier	Molecular Devices	200B
Micromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500