Overview
이 프로토콜은 전세포 패치 클램프 전기 생리학에게 불린 기술을 기술합니다, 얼룩말 물고기 태아에 있는 Mauthner 뉴런 및 그밖 망상 척추 세포의 전기적 특성을 공부하는 방법입니다.
Protocol
1. 패치 클램프 레코딩(전체 셀 모드)
- 모든 레코딩은 전체 셀 패치 클램프 모드에서 수행됩니다. 기록 챔버는 전기 생리학 설정에서 현미경 단계에 배치됩니다. 우리의 단계는 고정되고 직립 패치 클램프 현미경은 이동식 현미경 플랫폼 또는 현미경 번역기에 볼트됩니다.
- 패치 클램프 파이펫은 수평 풀러에 당겨져 있습니다(P-97; 서터 인스트루먼트 (주) WPI에서 얻은 얇은 벽의 보로실리케이트 유리에서. 파이펫 팁 직경은 부드러운 가장자리로 연마 한 후 0.2-0.4 μm의 순서에 있으며 생크 테이퍼는 길이가 ~ 4mm입니다.
- 전기 생리학 설정에서 증폭기 헤드 스테이지에 파이펫을 부착합니다. 이것은 Mauthner 셀에 높은 저항 씰의 형성에 적합한 파이펫에 대한 진입각을 보장하기 때문에 수평 축에 약 45 ° 각도로 헤드 스테이지를 유지하는 것이 중요합니다.
- 목욕 용액에 들어가기 직전에 파이펫에 소량의 양압을 적용하여 팁을 더럽히기 의 가능성을 줄입니다. mEPSC를 기록할 때, 목욕 솔루션에는 작용 잠재력을 차단하는 1μM TTX, 글리신 수용체를 차단하는 5 μM strychnine 및 GABAA 수용체를 차단하는 100 μM 비큐컬린 또는 100 μM 피록신이 포함됩니다. mIPSC를 기록할 때, 목욕 솔루션에는 관심 있는 수용체 활동에 따라 1 μM TTX, 키누레닉 산 및 비큐컬린 또는 스트리크닌이 포함됩니다.
- 파이펫에서 소량의 양압으로 M 셀에 접근하십시오. 양압은 세포를 좌우로 부드럽게 밀어내고 세포 위에 바로 배치하면 세포막에 작은 보조개가 형성됩니다. 파이펫과 멤브레인 사이의 강한 씰이 형성될 수 있도록 셀 표면을 부드럽게 청소하기 위해 몇 초 동안 파이펫을 제자리에 둡니다. 파이펫에서 양압을 방출하면 씰이 시정될 수 있으며 음의 파이펫 전위와 결합된 소량의 음압이 결합되어 기가Ω 씰이 몇 초 이내에 형성됩니다.
- 증폭기의 보유 잠재력을 -60 mV로 변경합니다. 흡입의 짧은 펄스의 시리즈로 세포막을 파열. 멤브레인 잠재력을 즉시 기록하고 커패시턴스 아티팩트를 최소화합니다. 세포 정전 용량(Cm) 및 접근(계열) 저항(Ra)을 70-85% 보상합니다. Ra는 30초마다 1분마다 정기적으로 모니터링되어야 하며, 20% 이상의 변화가 있는 경우 실험을 중단해야 합니다.
- 실험이 끝나고 충분한 데이터가 수집되면 한 쌍의 집게로 뒷뇌를 제거하여 준비가 희생됩니다. 이 시점에서 데이터 분석을 시작할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
