Overview
يصف هذا البروتوكول تقنية تسمى الفيزيولوجيا الكهربية المشبكية للخلايا الكاملة ، وهي طريقة لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية ماوثنر وغيرها من الخلايا الشبكية في أجنة حمار وحشي.
Protocol
1. التصحيح المشبك تسجيل (وضع الخلية الكاملة)
- يتم تنفيذ جميع التسجيلات في وضع المشبك التصحيح الخلية بأكملها. يتم وضع غرف التسجيل على مرحلة المجهر في إعداد الفيزيولوجيا الكهربية. يتم إصلاح مراحلنا ويتم تثبيت مجهر المشبك التصحيح تستقيم إلى منصة المجهر المنقولة أو مترجم المجهر.
- يتم سحب ماصة المشبك التصحيح على سحب أفقي (P-97; شركة سوتر للأدوات) من رقيقة الجدران، والزجاج البوروسيليكات التي تم الحصول عليها من WPI. أقطار تلميح ماصة هي على ترتيب 0.2-0.4 ميكرومتر بعد تلميع النار إلى حافة ناعمة، وتفتق ساق هو ~ 4 ملم في الطول.
- إرفاق ماصة إلى مكبر للصوت رئيس المرحلة في الإعداد الكهربية. من المهم الحفاظ على مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة تقريبا إلى المحور الأفقي لأن هذا يضمن زاوية دخول للمصصة المناسبة لتشكيل أختام مقاومة عالية على خلية Mauthner.
- فقط قبل دخول حل الحمام، وتطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على ماصة للحد من فرصة لتسخين طرف. عند تسجيل mEPSCs, وتشمل حلول حمام 1 μM TTX لمنع إمكانات العمل, 5 ميكرومتر strychnine لمنع مستقبلات الجليسين و 10 ميكرومتر بيكوكلين أو 100 ميكرومتر بيكروثوكين لمنع مستقبلات GABAA. عند تسجيل mIPSCs, وتشمل حلول حمام 1 μM TTX, حمض kynurenic وإما bicuculline أو الاستركنين اعتمادا على نشاط مستقبلات الفائدة.
- الاقتراب من الخلية M مع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي في ماصة. الضغط الإيجابي يدفع بلطف الخلية من جانب إلى آخر، وعندما وضعت على الفور على الخلية، يشكل غمازة صغيرة على غشاء الخلية. ترك ماصة في مكان لبضع ثوان لتنظيف بلطف سطح الخلية بحيث يمكن تشكيل ختم قوي بين ماصة والغشاء. الإفراج عن الضغط الإيجابي في ماصة يسمح الختم أن تبدأ وكمية صغيرة من الضغط السلبي إلى جانب إمكانات ماصة السلبية النتائج في الأختام GigaΩ تشكيل في غضون ثوان قليلة.
- تغيير إمكانية عقد على مكبر للصوت إلى -60 mV. تمزق غشاء الخلية مع سلسلة من نبضات قصيرة من الشفط. سجل على الفور إمكانات الأغشية وتقليل القطع الأثرية السعة. تعويض سعة الخلية (Cm) ومقاومة الوصول (السلسلة) (Ra) بنسبة 70-85٪. يجب مراقبة Ra بشكل روتيني ، كل 30 ثانية إلى دقيقة ، وإذا كان هناك تغيير بنسبة 20٪ أو أكثر ، قم بإجهاض التجربة.
- بمجرد انتهاء التجربة والحصول على بيانات كافية ، يتم التضحية بالتحضير عن طريق إزالة الدماغ الخلفي بزوج من ملقط. عند هذه النقطة، يمكن أن يبدأ تحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
