Overview
यह प्रोटोकॉल पूरे सेल पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी नामक तकनीक का वर्णन करता है, जो जेब्राफिश भ्रूण में मौथनर न्यूरॉन्स और अन्य रेटिकुलोस्पिनल कोशिकाओं के विद्युत गुणों का अध्ययन करने की एक विधि है।
Protocol
1. पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग (पूरे सेल मोड)
- सभी रिकॉर्डिंग पूरे सेल पैच क्लैंप मोड में किया जाता है। रिकॉर्डिंग कक्षों को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप में माइक्रोस्कोप चरण पर रखा जाता है। हमारे चरण तय होते हैं और ईमानदार पैच क्लैंप माइक्रोस्कोप को चल माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म या माइक्रोस्कोप अनुवादक के पास बोल्ड किया जाता है।
- पैच क्लैंप पिपेट को क्षैतिज खींचने वाले (पी-97) पर खींचा जाता है; सूटर इंस्ट्रूमेंट्स कं) पतली दीवारों से, डब्ल्यूपीआई से प्राप्त बोरोसिलिकेट ग्लास। पिपेट टिप व्यास एक चिकनी बढ़त के लिए आग चमकाने के बाद 0.2-0.4 माइक्रोन के आदेश पर हैं, और टांग टेपर लंबाई में ~ 4 मिमी है।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप में एम्पलीफायर हेड-स्टेज पर पिपेट संलग्न करें। क्षैतिज धुरी के लिए लगभग 45 डिग्री कोण पर सिर-चरण रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पिपेट के लिए एक प्रवेश कोण सुनिश्चित करता है जो मौथनर सेल पर उच्च प्रतिरोध जवानों के गठन के लिए उपयुक्त है।
- स्नान समाधान में प्रवेश करने से ठीक पहले, टिप को गंदे करने की संभावना को कम करने के लिए पिपेट पर सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू करें। mEPSCs रिकॉर्डिंग करते समय, स्नान समाधानों में कार्रवाई क्षमता को अवरुद्ध करने के लिए 1 μM TTX, ग्लाइसिन रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए 5 माइक्रोन स्ट्राइचनिन और 10 माइक्रोन बाइक्यूललाइन या 100 माइक्रोन पिरोटॉक्सिन शामिल हैं जो GABAA रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए। एमआईपीएससी रिकॉर्ड करते समय, स्नान समाधानों में ब्याज की रिसेप्टर गतिविधि के आधार पर 1 माइक्रोन टीटीएक्स, किन्यूरेनिक एसिड और या तो बाइक्यूलाइन या स्ट्राइचनिन शामिल हैं।
- पिपेट में थोड़ी मात्रा में सकारात्मक दबाव के साथ एम-सेल से संपर्क करें। सकारात्मक दबाव धीरे-धीरे कोशिका को एक तरफ से धक्का देता है और जब कोशिका पर तुरंत तैनात होता है, तो कोशिका झिल्ली पर एक छोटा डिंपल बनाता है। पिपेट को कुछ सेकंड के लिए छोड़ दें ताकि कोशिका की सतह को धीरे-धीरे साफ किया जा सके ताकि पिपेट और झिल्ली के बीच एक मजबूत सील बनाई जा सके। पिपेट में सकारात्मक दबाव जारी करने से सील शुरू हो जाती है और नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि के साथ-साथ गीगाΩ जवानों में नकारात्मक पिपेट संभावित परिणाम होते हैं जो कुछ सेकंड के भीतर बनाते हैं।
- एम्पलीफायर पर होल्डिंग क्षमता को -60 mV में बदलें। सक्शन की छोटी दालों की एक श्रृंखला के साथ कोशिका झिल्ली टूटना। तुरंत झिल्ली की क्षमता रिकॉर्ड करें और क्षमता कलाकृतियों को कम करें। सेल कैपेसिटी (सेमी) और एक्सेस (सीरीज) रेजिस्टेंस (आरए) को 70-85% तक मुआवजा दें। रा नियमित रूप से निगरानी की जानी चाहिए, हर 30 सेकंड एक मिनट के लिए, और अगर वहां 20% या उससे अधिक का परिवर्तन है, प्रयोग गर्भपात ।
- एक बार प्रयोग समाप्त हो जाने और पर्याप्त डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, एक जोड़ी संदंश के साथ हिंडब्रेन को हटाकर तैयारी की बलि दी जाती है। इस बिंदु पर, डेटा विश्लेषण शुरू हो सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
