Helcellig patchklämma elektrofysiologi: En metod för att studera neuroners elektriska egenskaper

Overview

Detta protokoll beskriver en teknik som kallas helcellig patch clamp elektrofysiologi, som är en metod för att studera elektriska egenskaper hos Mauthner nervceller och andra reticulospinal celler i zebrafisk embryon.

Protocol

1. Iartikel 3.1 i Patch Clamp Inspelning (hela cellläget)

1. Alla inspelningar utförs i hela cell patch clamp-läget. Inspelningskammare placeras på ett mikroskopstadium i en elektrofysiologiinställning. Våra steg är fasta och det upprättstående patchklämmamikroskopet bultas till en rörlig mikroskopplattform eller en mikroskopöversättare.
2. Patchklämmapipetter dras på en horisontell puller (P-97; Sutter Instrument Co.) från tunnväggigt borosilikatglas från WPI. Pipettspetsdiametrar är i storleksordningen 0,2-0,4 μm efter brandspolering till en slät kant, och skaftsmalten är ~ 4 mm lång.
3. Fäst pipetten på förstärkarens huvudsteg i elektrofysiologiinställningen. Det är viktigt att hålla huvudsteget i ungefär 45° vinkel mot den horisontella axeln eftersom detta säkerställer en ingångsvinkel för pipetten som är lämplig för bildandet av högmotståndstätningar på Mauthner-cellen.
4. Strax innan du går in i badlösningen, applicera en liten mängd positivt tryck på pipetten för att minska risken för att smutsa ner spetsen. Vid registrering av mEPSCs inkluderar badlösningar 1 μM TTX för att blockera åtgärdspotentialer, 5 μM stryknin för att blockera glycinreceptorer och 10 μM bikukulin eller 100 μM picrotoxin för att blockera GABAA-receptorer. Vid registrering av mIPSCs inkluderar badlösningar 1 μM TTX, kynurensyra och antingen bikuculline eller stryknin beroende på receptoraktiviteten av intresse.
5. Närma dig M-cellen med en liten mängd positivt tryck i pipetten. Det positiva trycket pressar försiktigt cellen från sida till sida och när den placeras omedelbart över cellen bildar den en liten dimple på cellmembranet. Lämna pipetten på plats i några sekunder för att försiktigt rengöra cellytan så att en stark tätning mellan pipetten och membranet kan bildas. Om du släpper det positiva trycket i pipetten kan tätningen initieras och en liten mängd undertryck i kombination med negativa pipettpotentialer resulterar i att GigaΩ-tätningar bildas inom några sekunder.
6. Ändra hållpotentialen på förstärkaren till -60 mV. Spräck cellmembranet med en serie korta sugpulser. Registrera omedelbart membranpotentialer och minimera kapacitansartefakter. Kompensera cellacitans (Cm) och åtkomstmotstånd (serie) (Ra) med 70-85%. Ra bör övervakas rutinmässigt, var 30: e sekund till en minut, och om det finns en förändring på 20% eller mer, avbryt experimentet.
7. När experimentet är avslutat och tillräckligt med data har förvärvats offras preparatet genom att ta bort bakhjärnan med ett par tång. I det här läget kan dataanalysen börja.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette Puller	Sutter Instruments Co	P-97
Upright Patch clamp microscope	Leica Microsystems	DMLFSA
Amplifier	Molecular Devices	200B
Micromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500