Overview
Этот протокол описывает метод, называемый цельноклеточный патч зажим электрофизиологии, которая является методом для изучения электрических свойств нейронов Маутнера и других ретикулоспинальных клеток в эмбрионах зебры.
Protocol
1. Запись патча зажима (режим всей ячейки)
- Все записи выполняются в режиме зажима всего патча ячейки. Камеры записи помещаются на сцену микроскопа в электрофизиологии установки. Наши этапы фиксируются и вертикально патч зажим микроскоп болтами на подвижной платформы микроскопа или микроскоп переводчика.
- Патч зажим пипетки вытащил на горизонтальном шкиве (P-97; Саттер Инструменты Ко) из тонкостеного, борозиликатного стекла, полученного из WPI. Диаметр наконечника пипетки составляет порядка 0,2-0,4 мкм после полировки огня до гладкого края, а конус хвостовика составляет 4 мм в длину.
- Прикрепите пипетку к головной ступени усилителя в электрофизиологической установке. Важно держать головную ступень под углом примерно 45 градусов к горизонтальной оси, так как это обеспечивает угол входа для пипетки, которая подходит для формирования уплотнений высокого сопротивления на клетку Маутнера.
- Перед входом в раствор ванны нанесите небольшое количество положительного давления на пипетку, чтобы уменьшить вероятность ипачки кончика. При записи mEPSCs, ванна решения включают в себя 1 МК TTX, чтобы блокировать потенциал действия, 5 МКМ стрихнин для блокирования рецепторов глицина и 10 МКМ бикукуллин или 100 МК пикротоксин для блокирования рецепторов ГАМКА. При записи mIPSCs, ванна решения включают 1 МК ТТХ, кинуреновая кислота и либо бикукулин или стрихнин в зависимости от рецепторной активности интереса.
- Подойди к M-клетке с небольшим количеством положительного давления в пипете. Положительное давление мягко толкает клетку из стороны в сторону и при расположении непосредственно над клеткой, образует небольшую ямочки на клеточной мембране. Оставьте пипетку на месте на несколько секунд, чтобы аккуратно очистить поверхность клетки, чтобы образовалось сильное уплотнение между пипеткой и мембраной. Освобождение положительного давления в пипетку позволяет инициированию уплотнения и небольшому количеству отрицательного давления в сочетании с отрицательными пипетчатыми потенциалами приводит к формированию уплотнений Гигаа в течение нескольких секунд.
- Измените потенциал холдинга на усилителе на -60 мВ. Разрыв клеточной мембраны с серией коротких импульсов всасывания. Немедленно записывают мембранные потенциалы и минимизируют артефакты емкости. Компенсируют емкость клеток (Cm) и сопротивление доступа (серии) (Ra) на 70-85%. Ра следует регулярно контролировать, каждые 30 секунд до минуты, и если есть изменение 20% или более, прервать эксперимент.
- После того, как эксперимент закончился и было получено достаточно данных, препарат приносятся в жертву, удаляя задний мозг с парой типсов. На этом этапе может начаться анализ данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA | |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B | |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
