زيبرافيش تشريح الدماغ: تقنية بيولوجيا الأعصاب الأسماك

Overview

يصف هذا الفيديو تقنية التشتيت الدقيق للدماغ من سمكة حمار وحشي بالغة. هذه الطريقة تساعد في الحصول على الدماغ كله المستمدة من نيووسفيرس التي يمكن دراستها أكثر من ذلك.

Protocol

1. تشريح الدماغ حمار وحشي الكبار

1. إعداد سرير تشريح عن طريق ملء طبق بيتري 100 ملم × 15 ملم مع حزم الجليد هلام. ثم ضع الغطاء على طبق بتري واحتضان في -20 درجة مئوية حتى يتجمد الجل. على رأس الغطاء وضع مربع من ورقة تصفية نظيفة والتفاف كل من ورقة التصفية وطبق بيتري مع فيلم من البلاستيك.
2. تنظيف وتعقيم جميع أدوات التشظي الدقيق بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الحرارة قبل كل استخدام. ضع جميع أدوات التشريح المعقمة بالقرب من المجهر التشريحي ، وقبل القتل الرحيم مباشرة ، ضع سرير التشريح تحت المجهر مع إضاءة الألياف البصرية.
3. جمع 2 حمار وحشي الكبار لإعداد المخ العصبي كله; و 3 إلى 4 حمار وحشي لتوليد الخلايا العصبية من مناطق الدماغ تشريح.
4. القتل الرحيم حمار وحشي الكبار (8-12 شهرا من العمر) باستخدام بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه. بعد ذلك، تزج الأسماك في الإيثانول 75٪ لمدة 5-10 ثانية ووضع بسرعة في السرير تشريح تليها قطع الرأس على مستوى الخياشيم باستخدام شفرة الجراحية.
   1. للقتل الرحيم للحيوانات، وإعطاء جرعة زائدة (300 ملغ / لتر) من الميثان الميثان tricaine حتى ضربات قلب الحيوان يبطئ تدريجيا وتوقف الدورة الدموية، ثم تزج في الماء المثلج.
5. بدوره الجانب الظهري الرأس إلى أسفل، واستخدام مقص جعل قطع طولية من الجانب قطع إلى الفم. باستخدام ملقط فضح قاعدة الجمجمة وإزالة جميع الأنسجة المجاورة. قطع الجدران الجانبية للجمجمة من بداية الحبل الشوكي نحو استئصال.
6. باستخدام المقص، وقطع وإزالة الأعصاب البصرية ومن ثم إزالة كلا الجانبين من الجزء الأكثر جانبية من الجمجمة على مستوى استئصال. بدوره الجانب البطني الرأس لأعلى. باستخدام ملقط، قشر قبالة بقية الجزء الأكثر apical من الجمجمة.
7. نقل الدماغ جنبا إلى جنب مع الجزء المتبقي من الجمجمة إلى طبق جديد مع وسيط تشريح (DMEM/F12 مع البنسلين / ستريبتومايسين). تنظيف أنسجة الدماغ في وسيلة تشريح باستخدام مقبض البلاستيك سكين صغيرة، والحفاظ على جميع هياكل الدماغ سليمة.
8. من هذه النقطة، مواصلة البروتوكول باستخدام الدماغ حمار وحشي كله.
   1. بدلا من ذلك تكييف هذا البروتوكول لمناطق الدماغ محددة لتوليد neurospheres من الدماغ حمار وحشي كامل أو من telencephalon، tectum / diencephalon أو المخيخ تشريح مع مشرط الطازجة. استخدام العصبية محددة حمار وحشي الفلورسنت خط المعدلة وراثيا العصبية لتشريح منطقة الدماغ من الفائدة وفقا لل الشكل 1.

Representative Results

الشكل 1: التمايز بين الغلافات العصبية المشتقة من الدماغ من زيبرافيش. (أ-ج, ه) صور تباين المرحلة من الخلايا العصبية المشتقة من الدماغ كلها المستزرعة في المتوسط Z-التمايز خلال 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) و 4 (C و D, DiVd4) أيام. (ه) عرض دورسال من الدماغ كله من 12 شهرا من العمر TG (GFAP: DsRed) حمار وحشي. تم تشريح الدماغ (Tel) و tectum (Tec) والمخيخ (Cer) وجمعها كما هو موضح. (D) صور من الغلاف العصبي DiVd4 المستمدة من استئصال, telencephalon والمخيخ في الممر 0 (P0), 1 (P1) و 2 (P2). شريط المقياس: 25 ميكرومتر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml