Zebrafisch Gehirn-Sektion: Eine Technik der Fisch-Neurobiologie

Overview

Dieses Video beschreibt die Technik der Mikrodissektion des Gehirns von einem erwachsenen Zebrafisch. Diese Methode hilft bei der Gewinnung von ganzen Gehirn abgeleiteten Neuorosphären, die weiter untersucht werden können.

Protocol

1. Zerlegung des erwachsenen Zebrafisch-Gehirns

1. Bereiten Sie ein Sezierbett vor, indem Sie eine 100 mm x 15 mm Petrischale mit Geleispackungen füllen. Dann den Deckel auf die Petrischale legen und bei -20 °C bebrüten, bis das Gel gefriert. Auf dem Deckel ein Quadrat aus sauberem Filterpapier aufstellen und sowohl das Filterpapier als auch die Petrischale mit Kunststofffolie umwickeln.
2. Reinigen und sterilisieren Sie alle Mikrodissektionsinstrumente vor jedem Gebrauch um 70 % Ethanol oder Wärme. Stellen Sie alle sterilisierten Sezierinstrumente in der Nähe des Seziermikroskops und stellen Sie das Sezierbett direkt vor der Euthanasie mit optischer Faserbeleuchtung unter das Mikroskop.
3. Sammeln Sie 2 erwachsene Zebrafische für eine ganze Gehirn Neurosphäre Vorbereitung; und 3 bis 4 Zebrafische, um Neurosphären aus sezierten Hirnregionen zu erzeugen.
4. Euthanisieren Sie erwachsene Zebrafische (8-12 Monate alt) mit einem Protokoll, das vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde. Als nächstes tauchen Sie den Fisch in 75% Ethanol für 5-10 sec und schnell in das Sezierbett, gefolgt von Enthauptung auf der Ebene der Kiemen mit einer chirurgischen Klinge.
   1. Um Tiere einzuschläfern, verabreichen Sie eine Überdosierung (300 mg/L) von Tricain-Methansulfonat, bis der Herzschlag des Tieres allmählich verlangsamt und die Zirkulation stoppt, dann in Eiswasser eintauchen.
5. Drehen Sie den Kopf dorsal Nachunten, und mit der Schere machen einen Längsschnitt von der geschnittenen Seite zum Mund. Mit den Zangen entblößen Sie die Basis des Schädels und entfernen Sie das gesamte benachbarte Gewebe. Schneiden Sie die Seitenwände des Schädels vom Anfang des Rückenmarks in Richtung des Tektums.
6. Schneiden und entfernen Sie mit der Schere die Sehnerven und entfernen Sie dann beide Seiten des seitlichsten Teils des Schädels auf der Ebene des Tektums. Drehen Sie den Kopf ventrale Seite nach oben. Mit Zangen den Rest des apikalsten Teils des Schädels abziehen.
7. Übertragen Sie das Gehirn zusammen mit dem restlichen Teil des Schädels in eine neue Schale mit dem Sezieren Medium (DMEM/F12 mit Penicillin /Streptomycin). Reinigen Sie das Hirngewebe im Seziermedium mit dem Kunststoffgriff des Mikromessers und halten Sie alle Gehirnstrukturen intakt.
8. Von diesem Punkt an, setzen Sie das Protokoll mit dem gesamten Zebrafisch Gehirn.
   1. Alternativ können Sie dieses Protokoll an bestimmte Hirnregionen anpassen, um Neurosphären aus dem gesamten Zebrafischhirn oder aus dem Telencephalon, Tectum/Diencephalon oder Kleinhirn zu erzeugen, das mit einem frischen Skalpell seziert wird. Verwenden Sie eine neuronale fluoreszierende zebrafische neuronale transgene Linie, um die von Interesse ezipierte Hirnregion gemäß Abbildung 1zu sezieren.

Representative Results

Abbildung 1: Differenzierung von Zebrafischen, die aus dem Gehirn stammen, Neurosphären. (A-C, E) Phasenkontrastbilder ganzer hirnabgeleiteter Neurosphären, die im Z-Differenzierungsmedium während 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) und 4 (C und D, DiVd4) Tagen kultiviert wurden. (E) Dorsale Ansicht des gesamten Gehirns eines 12 Monate alten Tg(GFAP:DsRed) Zebrafisches. Das Telencephalon (Tel), tectum (Tec) und das Kleinhirn (Cer) wurden seziert und gesammelt, wie gezeigt. (D) Bilder von DiVd4-Neurosphären, die aus dem Tectum, Telencephalon und Kleinhirn in Durchgang 0 (P0), 1 (P1) und 2 (P2) abgeleitet sind. Maßstabsleiste: 25 m.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml