Overview
यह वीडियो एक वयस्क जेब्राफिश से मस्तिष्क के माइक्रोडिसेक्शन की तकनीक का वर्णन करता है। यह विधि पूरे मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूओरोस्फीयर प्राप्त करने में मदद करती है जिसका आगे अध्ययन किया जा सकता है।
Protocol
1. वयस्क ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क का विच्छेदन
- जेल आइस पैक के साथ 100 एमएम एक्स 15 एमएम पेट्री डिश भरकर विच्छेदन बिस्तर तैयार करें। फिर पेट्री डिश पर ढक्कन रखें और जेल जमा होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ढक्कन के शीर्ष पर साफ फिल्टर पेपर का एक वर्ग रखें और प्लास्टिक फिल्म के साथ फिल्टर पेपर और पेट्री डिश दोनों लपेटें।
- प्रत्येक उपयोग से पहले सभी माइक्रोडिसेक्शन उपकरणों को 70% इथेनॉल या गर्मी से साफ और स्टरलाइज करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के पास सभी निष्फल विच्छेदन उपकरणों को रखें और इच्छामृत्यु से ठीक पहले, ऑप्टिकल फाइबर रोशनी के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे विच्छेदन बिस्तर रखें।
- एक पूरे मस्तिष्क न्यूरोस्फीयर तैयारी के लिए 2 वयस्क जेब्राफिश लीजिए; और विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से न्यूरोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए 3 से 4 जेब्राफिश।
- संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके वयस्क जेब्राफिश (8-12 महीने पुराना) को इच्छामृत्यु दें। इसके बाद, मछली को 5-10 सेकंड के लिए 75% इथेनॉल में विसर्जित करें और जल्दी से विच्छेदन बिस्तर में रखें जिसके बाद सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके गिलों के स्तर पर डेपुटेशन होता है।
- जानवरों को इच्छामृत्यु देने के लिए, ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट की ओवरडोज (300 मिलीग्राम/एल) का प्रशासन करें जब तक कि जानवर की दिल की धड़कन धीरे-धीरे धीमा न हो जाए और परिसंचरण बंद हो जाए, फिर आइस्ड पानी में विसर्जित न हो जाए।
- सिर पृष्ठीय पक्ष नीचे की ओर बारी है, और कैंची का उपयोग कर कटौती पक्ष से मुंह के लिए एक देशांतर कट बनाते हैं । संदंश का उपयोग खोपड़ी के आधार का पर्दाफाश और सभी आसन्न ऊतक को दूर। रीढ़ की हड्डी की शुरुआत से ही खोपड़ी की पार्श्व दीवारों को टेक्टम की ओर काट लें।
- कैंची का उपयोग करके, ऑप्टिक नसों को काटें और हटा दें और फिर टेक्टम के स्तर पर खोपड़ी के सबसे पार्श्व भाग के दोनों किनारों को हटा दें। सिर वेंट्रल साइड ऊपर की ओर मुड़ें। संदंश का उपयोग करना, खोपड़ी के सबसे एपिकल भाग के बाकी हिस्से को छील दें।
- मस्तिष्क को विच्छेदन माध्यम (DMEM/F12 पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एक नई डिश में खोपड़ी के शेष हिस्से के साथ स्थानांतरित करें)। मस्तिष्क की सभी संरचनाओं को बरकरार रखते हुए माइक्रो थॉयम के प्लास्टिक हैंडल का उपयोग करके विच्छेदन माध्यम में मस्तिष्क के ऊतकों को साफ करें।
- इस बिंदु से, पूरे जेब्राफिश मस्तिष्क का उपयोग करके प्रोटोकॉल जारी रखें।
- वैकल्पिक रूप से इस प्रोटोकॉल को विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में अनुकूलित करें ताकि पूरे जेब्राफिश मस्तिष्क से या टेलेंसेफेलन, टेक्टम/डाइएंसेफेलन या सेरिबैलम एक ताजा स्केलपेल के साथ विच्छेदित से न्यूरोस्फीयर उत्पन्न किया जा सके। चित्रा 1के अनुसार ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को विच्छेदन करने के लिए तंत्रिका विशिष्ट फ्लोरोसेंट जेब्राफिश न्यूरल ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करें ।
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Representative Results
चित्रा 1: जेब्राफिश मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर का भेदभाव। (A-C, E) 1(ए,DiVd1), 3(बी,DiVd3) और 4(सी और डी,DiVd4) दिनों के दौरान जेड-विभेदन माध्यम में सुसंस्कृत पूरे मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर की चरण विपरीत छवियां। (ई)एक 12 महीने पुराने टीजी (GFAP: DsRed) जेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क का पृष्ठीय दृश्य । टेलेंसेफेलन (टेल), टेक्टम (टेक) और सेरिबैलम (सीईआर) को विच्छेदित किया गया और दिखाया गया। (घ)डीआईवीडी4 न्यूरोस्फीयर की छवियां टेक्टम, टेलेंसेफलन और सेरिबैलम से पैसेज 0 (पी0), 1 (पी 1) और 2 (पी 2) में प्राप्त हुईं । स्केल बार: 25 माइक्रोन।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml |
