Zebrafish Brain Disseksjon: En teknikk for fiskenevronbiologi

Overview

Denne videoen beskriver teknikken for mikrodisseksjon av hjernen fra en voksen sebrafisk. Denne metoden bidrar til å skaffe hele hjernen avledede nøyorosfærer som kan studeres videre.

Protocol

1. Disseksjon av den voksne sebrafiskhjernen

1. Forbered en disseksjonsseng ved å fylle en 100 mm x 15 mm Petri-tallerken med gelispakker. Legg deretter lokket på petriskålen og inkuber ved -20 °C til gelen fryser. På toppen av lokket plasserer du en firkant med rent filterpapir og pakker både filterpapiret og petriskålen med plastfilm.
2. Rengjør og steriliser alle mikrodeseksjonsinstrumentene med 70 % etanol eller varme før hver bruk. Plasser alle steriliserte disseksjonsinstrumenter i nærheten av dissekeringsmikroskopet, og rett før eutanasi, plasser disseksjonssengen under mikroskopet med optisk fiberbelysning.
3. Samle 2 voksne sebrafisk for en hel hjerne neurosphere forberedelse; og 3 til 4 sebrafisk for å generere nevrosfærer fra dissekerte hjerneregioner.
4. Euthanize voksen sebrafisk (8-12 måneder gammel) ved hjelp av en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee. Deretter nedsenker du fisken i 75% etanol i 5-10 sek og plasserer raskt i disseksjonssengen etterfulgt av halshugging på gjellenes nivå ved hjelp av et kirurgisk blad.
   1. For å avlive dyr, administrer en overdose (300 mg /L) trikain metansulfat til dyrets hjerteslag gradvis bremser og sirkulasjonen stopper, og deretter nedsenkes i isvann.
5. Vri hodet dorsal side ned, og bruk saksen gjør en langsgående kutt fra kuttsiden til munnen. Bruk tangene utsetter bunnen av skallen og fjerner alt tilstøtende vev. Klipp sideveggene i skallen fra begynnelsen av ryggmargen mot tectum.
6. Bruk saksen, kutt og fjern optiske nerver og fjern deretter begge sider av den mest laterale delen av skallen på nivået av tectum. Vri hodet ventral side opp. Bruk tang, skrell av resten av den mest apikale delen av skallen.
7. Overfør hjernen sammen med den resterende delen av skallen til en ny tallerken med disseksjonsmediet (DMEM / F12 med Penicillin / Streptomycin). Rengjør hjernevevet i disseksjonsmediet ved hjelp av mikroknivens plasthåndtak, og hold alle hjernestrukturer intakte.
8. Fra dette punktet, fortsett protokollen ved hjelp av hele sebrafiskhjernen.
   1. Alternativt tilpasse denne protokollen til spesifikke hjerneregioner for å generere nevrosfærer fra hele sebrafiskhjernen eller fra telencephalon, tectum / diencephalon eller cerebellum dissekert med en frisk skalpell. Bruk en nevral spesifikk fluorescerende sebrafisk nevral transgen linje for å dissekere hjerneregionen av interesse i henhold til figur 1.

Representative Results

Figur 1: Differensiering av sebrafisk hjerneavledede nevrosfærer. (A-C, E) Fasekontrastbilder av hele hjerneavledede nevrosfærer dyrket i Z-differensieringsmediet i løpet av 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) og 4 (C og D, DiVd4) dager. (E) Dorsal syn på hele hjernen til en 12 måneder gammel Tg (GFAP: DsRed) sebrafisk. Telencephalon (Tlf), tectum (Tec) og cerebellum (Cer) ble dissekert og samlet som vist. (D) Bilder av DiVd4 nevrosfærer avledet fra tectum, telencephalon og cerebellum ved Passage 0 (P0), 1 (P1) og 2 (P2). Skala bar: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml