ניתוח מוח זברהפיש: טכניקה של נוירוביולוגיה דגים

Overview

סרטון זה מתאר את הטכניקה של מיקרו-דיסקציה של המוח מדג זברה בוגר. שיטה זו מסייעת בהשגת נוירוספרות המופקות על ידי המוח כולו שניתן ללמוד עוד יותר.

Protocol

1. ניתוח מוח דג הזברה הבוגר

1. הכינו מיטת ניתוח על ידי מילוי צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ עם חבילות קרח ג'ל. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת הפטרי ומדגרים ב -20 מעלות צלזיוס עד שהג'ל קופא. על גבי המכסה מניחים ריבוע של נייר סינון נקי ועוטפים גם את נייר המסנן וגם את צלחת הפטרי בסרט פלסטיק.
2. יש לנקות ולחטא את כל מכשירי המיקרו-דיסקציה ב-70% אתנול או חום לפני כל שימוש. מניחים את כל מכשירי הניתוח המעוקרים ליד המיקרוסקופ הנבדק, וממש לפני המתת החסד, מניחים את מיטת הניתוח מתחת למיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטיים.
3. לאסוף 2 זברה למבוגרים להכנת נוירוספרה במוח כולו; ו 3 עד 4 זברה כדי ליצור נוירוספרות מאזורי מוח מנותח.
4. המתת חסד של דג זברה בוגר (בן 8-12 חודשים) באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לאחר מכן, לטבול את הדגים 75% אתנול במשך 5-10 שניות ומניחים במהירות במיטת הניתוח ואחריו עריפת ראשים ברמת הזימים באמצעות להב כירורגי.
   1. כדי להרדים בעלי חיים, לנהל מנת יתר (300 מ"ג / ליטר) של מתנסולפונט tricaine עד פעימות הלב של החיה בהדרגה להאט את זרימת הדם מפסיק, ואז לטבול במים קרים.
5. סובבו את צד הגב של הראש כלפי מטה, ושימוש במספריים מבצעים חתך אורך מהצד החתוך אל הפה. שימוש במלקחיים לחשוף את הבסיס של הגולגולת ולהסיר את כל הרקמה הסמוכה. חותכים את הקירות לרוחב של הגולגולת מתחילת חוט השדרה לכיוון tectum.
6. באמצעות המספריים, לחתוך ולהסיר את עצבי הראייה ולאחר מכן להסיר את שני הצדדים של החלק הצדדי ביותר של הגולגולת ברמה של tectum. תסובב את הצד הגחוני של הראש. באמצעות מלקחיים, לקלף את שאר החלק הכי apical של הגולגולת.
7. להעביר את המוח יחד עם החלק הנותר של הגולגולת לתוך צלחת חדשה עם מדיום הניתוח (DMEM / F12 עם פניצילין / סטרפטומיצין). נקה את רקמת המוח באמצעי הניתוח באמצעות ידית הפלסטיק של סכין המיקרו, תוך שמירה על כל מבני המוח שלמים.
8. מנקודה זו, להמשיך את הפרוטוקול באמצעות המוח כולו זברה.
   1. לחלופין, התאימו פרוטוקול זה לאזורי מוח ספציפיים כדי ליצור נוירוספרות ממוחו של דג זברה שלם או מהטלנצפלון, הטלנקום/דיאנצפלון או המוח הקטן המנותחים באזמל טרי. השתמש בקו ארנזי עצבי פלואורסצנטי ספציפי לזברה כדי לנתח את אזור העניין במוח על פי איור 1.

Representative Results

איור 1: בידול של נוירוספרות במוח של דגי זברה. (A-C, E) תמונות ניגודיות פאזה של נוירוספרות שלמות שמקורן במוח בתרבית במדיום Z-בידול במהלך 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ו 4 (C ו- D, DiVd4) ימים. (E)מבט גב של המוח כולו של דג זברה בן 12 חודשים Tg(GFAP:DsRed). הטלאנצפלון (טל), הטקטום (טק) והמוח הקטן (Cer) נותחו ונאספו כפי שמוצג. (D)תמונות של נוירוספרות DiVd4 הנגזרות מהקטקום, הטלאנצפלון והמוח הקטן במעבר 0 (P0), 1 (P1) ו-2 (P2). סרגל קנה מידה: 25 מיקרומטר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml