ゼブラフィッシュ脳解剖:魚の神経生物学の技術

Overview

このビデオでは、成体のゼブラフィッシュから脳のマイクロディセクションの技術について説明します。この方法は、さらに研究することができる全脳由来の神経球を得るのに役立つ。

Protocol

1. 成人ゼブラフィッシュ脳の解剖

1. 100 mm x 15 mm ペトリ皿にゲルアイスパックを充填して、解剖用ベッドを用意します。その後、シャーレに蓋を置き、ゲルが凍るまで-20°Cでインキュベートします。蓋の上にきれいなろ紙の正方形を置き、プラスチックフィルムで濾紙とシャーレの両方を包みます。
2. すべてのマイクロディスセクション器具を70%エタノールまたは熱で洗浄し、各使用前に殺菌します。解剖顕微鏡の近くに全滅解剖器を置き、安楽死の直前に、解剖ベッドを光ファイバー照明で顕微鏡の下に置きます。
3. 脳神経球の準備のための2成虫ゼブラフィッシュを収集します。解剖された脳領域から神経球を生成する3〜4ゼブラフィッシュ。
4. 教育機関動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、成体ゼブラフィッシュ(8-12ヶ月)を安楽死させます。次に、魚を75%エタノールに5〜10秒間浸し、すぐに解剖床に入れ、手術用ブレードを使用してエラのレベルで切断します。
   1. 動物を安楽死させるために、トリカインメタンスルホン酸の過剰摂取(300mg/L)を投与し、動物の心臓拍動が徐々に減速して循環が止まるまで、氷水に浸す。
5. 頭背側を下に曲げ、はさみを使用して、切り取った側から口に縦切りを作ります。鉗子を使用して頭蓋骨の基盤を露出し、すべての隣接する組織を取除く。脊髄の始まりから脊椎の側面をテクタムに向かって切ります。
6. はさみを使用して、視神経を切断して取り除き、頭蓋骨の最も外側の部分の両側をテクタムのレベルで取り除きます。頭腹側を上に回します。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も有端な部分の残りの部分を剥がします。
7. 頭蓋骨の残りの部分と一緒に脳を解剖媒体(ペニシリン/ストレプトマイシン付きDMEM/ F12)で新しい皿に移します。マイクロナイフのプラスチックハンドルを使用して解剖媒体の脳組織をきれいにし、すべての脳構造をそのままに保ちます。
8. この時点から、ゼブラフィッシュの脳全体を使用してプロトコルを継続します。
   1. あるいは、このプロトコルを特定の脳領域に適応させ、ゼブラフィッシュの脳全体またはテレンシアロン、テクタム/ジエンスファロン、または新しいメスで解剖された小脳から神経球を生成する。神経特異的蛍光ゼブラフィッシュ神経トランスジェニックラインを使用して、目的の脳領域を解剖する。

Representative Results

図1:ゼブラフィッシュ脳由来神経球の分化(A-C, E)Z分化培地で培養した全脳由来神経球の全脳由来神経球の位相コントラスト画像(A、DiVd1)、3(B、DiVd3)及び4(C及びD、DiVd4)の間に。 (E) 生後12か月のTg(GFAP:DsRed)ゼブラフィッシュの脳全体のドーサル図。テレンセファロン(Tel)、テクタム(テック)、小脳(Cer)は、示すように解剖され、収集されました。(D) パッセージ0(P0)、1(P1)、2(P2)におけるテクタム、テレンスファロンおよび小脳に由来するDiVd4神経球の画像。スケールバー:25 μm。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml