Dissection du cerveau du poisson zèbre : une technique de neurobiologie du poisson

Overview

Cette vidéo décrit la technique de microdissection du cerveau à partir d’un poisson zèbre adulte. Cette méthode aide à obtenir des neuorosphères dérivées du cerveau entier qui peuvent être étudiées plus avant.

Protocol

1. Dissection du cerveau adulte de poisson zèbre

1. Préparer un lit de dissection en remplissant un plat Petri de 100 mm x 15 mm avec des paquets de glace en gel. Ensuite, placez le couvercle sur la boîte de Pétri et incubez à -20 °C jusqu’à ce que le gel gèle. Sur le dessus du couvercle placer un carré de papier filtre propre et envelopper à la fois le papier filtre et la boîte de Pétri avec du film plastique.
2. Nettoyez et stérilisez tous les instruments de microdissection à 70 % d’éthanol ou de chaleur avant chaque utilisation. Placez tous les instruments de dissection stérilisés près du microscope disséquant et, juste avant l’euthanasie, placez le lit de dissection sous le microscope avec l’illumination de fibre optique.
3. Recueillir 2 poissons zèbres adultes pour une préparation entière de la neurosphère cérébrale; et 3 à 4 poissons zèbres pour générer des neurosphères à partir de régions du cerveau disséquées.
4. Euthanasier le poisson zèbre adulte (8-12 mois) à l’aide d’un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Ensuite, plongez le poisson dans 75% d’éthanol pendant 5-10 sec et placez rapidement dans le lit de dissection suivi d’une décapitation au niveau des branchies à l’aide d’une lame chirurgicale.
   1. Pour euthanasier les animaux, administrer une surdose (300 mg/L) de méthane de tricaine jusqu’à ce que le rythme cardiaque de l’animal ralentit graduellement et que la circulation s’arrête, puis plongez dans de l’eau glacée.
5. Tournez le côté dorsale de la tête vers le bas, et en utilisant les ciseaux faire une coupe longitudinale du côté coupé à la bouche. En utilisant les forceps exposer la base du crâne et enlever tous les tissus adjacents. Couper les parois latérales du crâne depuis le début de la moelle épinière vers le tectum.
6. À l’aide des ciseaux, couper et enlever les nerfs optiques, puis enlever les deux côtés de la partie la plus latérale du crâne au niveau du tectum. Tournez le côté ventral de la tête vers le haut. À l’aide de forceps, décoller le reste de la partie la plus apical du crâne.
7. Transférer le cerveau avec la partie restante du crâne dans un nouveau plat avec le milieu de dissection (DMEM/F12 avec pénicilline /streptomycine). Nettoyez le tissu cérébral dans le milieu de dissection à l’aide de la poignée en plastique du micro couteau, en gardant toutes les structures cérébrales intactes.
8. À partir de ce point, continuer le protocole en utilisant l’ensemble du cerveau zebrafish.
   1. Adapter alternativement ce protocole à des régions cérébrales spécifiques pour générer des neurosphères à partir du cerveau entier du poisson zèbre ou du télencéphale, du tectum/diencephalon ou du cervelet disséqué avec un scalpel frais. Utilisez une lignée transgénique neurale spécifique au poisson zèbre fluorescent pour disséquer la région cérébrale d’intérêt selon la figure 1.

Representative Results

Figure 1 : Différenciation des neurosphères dérivées du poisson zèbre. (A-C, E) Images de contraste de phase de neurosphères dérivées du cerveau entiers cultivés dans le milieu de différenciation Z pendant 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) et 4 (C et D, DiVd4) jours. (E) Vue dorsale de l’ensemble du cerveau d’un poisson zèbre de 12 mois Tg (GFAP:DsRed). Le télencéphale (Tel), le tectum (Tec) et le cervelet (Cer) ont été disséqués et recueillis comme indiqué. (D) Images de neurosphères DiVd4 dérivées du tectum, télencéphale et cervelet au passage 0 (P0), 1 (P1) et 2 (P2). Barre d’échelle : 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml