Dissezione cerebrale zebrafish: una tecnica di neurobiologia del pesce

Overview

Questo video descrive la tecnica della microdisezione del cervello da un pesce zebra adulto. Questo metodo aiuta ad ottenere rorosfere derivate dal cervello intero che possono essere ulteriormente studiate.

Protocol

1. Dissezione del cervello di zebrafish adulto

1. Preparare un letto di dissezione riempiendo una piastra di Petri da 100 mm x 15 mm con confezioni di ghiaccio in gel. Quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e incubare a -20 °C fino a quando il gel non si congela. Sopra il coperchio posizionare un quadrato di carta da filtro pulita e avvolgere sia la carta filtrante che la piastra di Petri con pellicola di plastica.
2. Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti di microdisezione del 70% di etanolo o calore prima di ogni utilizzo. Posizionare tutti gli strumenti di dissezione sterilizzati vicino al microscopio di sezionazione e, subito prima dell'eutanasia, posizionare il letto di dissezione al microscopio con illuminazione in fibra ottica.
3. Raccogli 2 zebrafish adulti per un'intera preparazione della neurosfera cerebrale; e da 3 a 4 zebrafish per generare neurosfere da regioni cerebrali sezionate.
4. Eutanasia del pesce zebra adulto (8-12 mesi) utilizzando un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Successivamente, immergere il pesce nel 75% di etanolo per 5-10 secondi e posizionarsi rapidamente nel letto di dissezione seguito da decapitazione a livello delle branchie utilizzando una lama chirurgica.
   1. Per eutanasiare gli animali, somministrare un sovradosaggio (300 mg/L) di tricaina metanosolfonato fino a quando il battito cardiaco dell'animale rallenta gradualmente e la circolazione si ferma, quindi immergersi in acqua ghiacciata.
5. Gira il lato dorsale della testa verso il basso e usando le forbici fai un taglio longitudinale dal lato tagliato alla bocca. Usando le forcep esporre la base del cranio e rimuovere tutto il tessuto adiacente. Tagliare le pareti laterali del cranio dall'inizio del midollo spinale verso il tectum.
6. Usando le forbici, tagliare e rimuovere i nervi ottici e quindi rimuovere entrambi i lati della parte più laterale del cranio a livello del tectum. Ruotare il lato ventrale della testa verso l'alto. Usando le forcep, staccare il resto della parte più apicica del cranio.
7. Trasferire il cervello insieme alla restante parte del cranio in un nuovo piatto con il mezzo di dissezione (DMEM/F12 con Penicillina /Streptomicina). Pulire il tessuto cerebrale nel mezzo di dissezione utilizzando la maniglia di plastica del micro coltello, mantenendo intatte tutte le strutture cerebrali.
8. Da questo punto, continua il protocollo usando l'intero cervello di zebrafish.
   1. In alternativa adatta questo protocollo a specifiche regioni cerebrali per generare neurosfere da tutto il cervello di zebrafish o dal telencefalo, tectum / diencefalo o cervelletto sezionato con un bisturi fresco. Utilizzare una linea transgenica neurale specifica per il pesce zebra fluorescente per sezionare la regione cerebrale di interesse secondo la figura 1.

Representative Results

Figura 1: Differenziazione delle neurosfere derivate dal cervello di Zebrafish. (A-C, E) Immagini di contrasto di fase di intere neurosfere derivate dal cervello coltivate nel mezzo di differenziazione Z durante 1(A,DiVd1), 3(B,DiVd3) e 4 (C e D, DiVd4) giorni. (E) Visione dorsale di tutto il cervello di un pesce zebra Tg(GFAP:DsRed) di 12 mesi. Il telencefalo (Tel), il tectum (Tec) e il cervelletto (Cer) sono stati sezionati e raccolti come mostrato. (D) Immagini delle neurosfere DiVd4 derivate dallo tectum, dal telencefalo e dal cervelletto al passaggio 0 (P0), 1 (P1) e 2 (P2). Barra di scala: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml