Dissecção cerebral de zebrafish: uma técnica de neurobiologia de peixe

Overview

Este vídeo descreve a técnica de microdisseção do cérebro de um zebrafish adulto. Este método ajuda na obtenção de neuorosferas cerebrais inteiras que podem ser estudadas mais adiante.

Protocol

1. Dissecção do Cérebro adulto de zebrafish

1. Prepare uma cama de dissecção preenchendo uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm com blocos de gelo de gel. Em seguida, coloque a tampa na placa de petri e incubar a -20 °C até que o gel congele. Em cima da tampa coloque um quadrado de papel filtro limpo e enrole tanto o papel filtro quanto a placa de petri com filme plástico.
2. Limpe e esterilize todos os instrumentos de microdisseção em 70% de etanol ou calor antes de cada uso. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, coloque o leito de dissecção sob o microscópio com iluminação de fibra óptica.
3. Coletar 2 zebrafish adultos para uma preparação da neurosfera cerebral inteira; e 3 a 4 zebrafish para gerar neurosferas a partir de regiões cerebrais dissecadas.
4. Eutanásia de zebrafish adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Em seguida, mergulhe o peixe em 75% de etanol por 5-10 segundos e coloque rapidamente no leito de dissecção seguido de decapitação ao nível das brânquias usando uma lâmina cirúrgica.
   1. Para eutanásia dos animais, administre uma overdose (300 mg/L) de metano tricaine até que o batimento cardíaco do animal desacelere gradualmente e a circulação pare, depois mergulhe em água gelada.
5. Vire a cabeça dorsal para baixo, e usando a tesoura faça um corte longitudinal do lado cortado para a boca. Usando as fórceps expõem a base do crânio e removem todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio desde o início da medula espinhal em direção ao tectum.
6. Usando a tesoura, corte e remova os nervos ópticos e, em seguida, remova ambos os lados da parte mais lateral do crânio ao nível do tectum. Vire a cabeça para cima. Usando fórceps, retire o resto da parte mais apical do crânio.
7. Transfira o cérebro junto com a parte restante do crânio em um novo prato com o meio de dissecção (DMEM/F12 com Penicilina /Streptomicina). Limpe o tecido cerebral no meio de dissecção usando a alça plástica da micro faca, mantendo todas as estruturas cerebrais intactas.
8. A partir deste ponto, continue o protocolo usando todo o cérebro de zebrafish.
   1. Alternativamente, adapte este protocolo a regiões cerebrais específicas para gerar neuroferas de cérebro de zebrafish inteiro ou do telencephalon, tectum/diencephalon ou cerebelo dissecado com um bisturi fresco. Use uma linha transgênica neural de zebrafish fluorescente específica neural para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 1.

Representative Results

Figura 1: Diferenciação das Neurosferas derivadas do cérebro de Zebrafish. (A-C, E) Imagens de contraste de fase de neuroferas derivadas do cérebro inteira cultivadas no meio de diferenciação Z durante os dias 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) e 4(C e D, DiVd4). (E) Visão dorsal de todo o cérebro de um zebrafish Tg (GFAP:DsRed) de 12 meses de idade. O telencephalon (Tel), tectum (Tec) e cerebelo (Cer) foram dissecados e coletados como mostrado. (D) Imagens de neuroferas DiVd4 derivadas do tectum, telencephalon e cerebelo na Passagem 0 (P0), 1 (P1) e 2 (P2). Barra de escala: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml