Зебрафиш мозга вскрытие: Техника рыбной нейробиологии

Overview

Это видео описывает технику микропересасывания мозга от взрослой зебры. Этот метод помогает в получении всего мозга производных нейоросфер, которые могут быть изучены дальше.

Protocol

1. Рассечение взрослого мозга зебры

1. Подготовьте кровать для вскрытия, заполнив 100 мм х 15 мм чашку Петри пакетами со льдом геля. Затем поместите крышку на чашку Петри и инкубировать при -20 градусов по Цельсию, пока гель не замерзнет. Поверх крышки поместите квадрат чистой фильтровальной бумаги и оберните и фильтровальную бумагу, и чашку Петри пластиковой пленкой.
2. Очистите и стерилизовать все инструменты микропересмешивания на 70% этанола или тепла перед каждым использованием. Поместите все стерилизованные инструменты вскрытия рядом с рассеченным микроскопом и, прямо перед эвтаназией, поместите кровать для вскрытия под микроскопом с оптическим освещением волокна.
3. Соберите 2 взрослых зебры для всего мозга нейросферы подготовки; и от 3 до 4 зебры для генерации нейросфер из вскрытых областей мозга.
4. Euthanize взрослых зебры (8-12 месяцев) с помощью протокола, утвержденного Институциональным комитетом по уходу за животными и использования. Затем погрузите рыбу в 75% этанола в течение 5-10 сек и быстро поместите в кровать для вскрытия с последующим обезглавливанием на уровне жабры с помощью хирургического лезвия.
   1. Чтобы усыплять животных, введите передозировку (300 мг/л) трикаина метансульфоната до тех пор, пока сердцебиение животного не замедлится и циркуляция не прекратится, а затем погрузитесь в ледяную воду.
5. Поверните головку спинной стороны вниз, и с помощью ножниц сделать продольный разрез от разреза стороны до рта. С помощью типсов обнажают основание черепа и удаляют все соседние ткани. Отрежьте боковой стенки черепа от начала спинного мозга к тектуму.
6. Используя ножницы, вырезать и удалить зрительные нервы, а затем удалить обе стороны из наиболее боковой части черепа на уровне тектума. Поверните голову брюшной стороны вверх. Используя типсы, снимите остальную часть самой апической части черепа.
7. Перенесите мозг вместе с оставшейся частью черепа в новое блюдо со средой вскрытия (DMEM/F12 с пенициллином/стрептомицином). Очистите ткани мозга в среде вскрытия с помощью пластиковой ручки микро-ножа, сохраняя все структуры мозга нетронутыми.
8. С этого момента, продолжить протокол, используя весь мозг зебры.
   1. Кроме того, адаптировать этот протокол к конкретным регионам мозга для создания нейросфер из всего мозга зебры или из теленцефалона, тектума / диенцефалона или мозжечка вскрыты свежим скальпелем. Используйте нейронную специфическую флуоресцентную нейронную трансгенную линию зебры, чтобы вскрыть область мозга, представляющих интерес в соответствии с рисунком 1.

Representative Results

Рисунок 1: Дифференциация нейросфер, полученных мозгом зебры. (A-C, E) Фазовые контрастные изображения целых нейросфер, полученных мозгом, которые культурируются в среде дифференциации в течение 1(A, DiVd1), 3(B, DiVd3) и 4(C и D, DiVd4) дней. (E) Дорсальный вид всего мозга 12-месячного Tg (GFAP:DsRed) зебры. Теленцефалон (Тел), тектум (Tec) и мозжечок (Cer) были вскрыты и собраны, как показано на фото. (D)Изображения нейросфер DiVd4, полученных из тектума, теленцефалона и мозжечка в проходе 0 (P0), 1 (P1) и 2 (P2). Шкала бар: 25 мкм.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml