Disección cerebral del pez cebra: una técnica de neurobiología de peces

Overview

Este video describe la técnica de microdisección del cerebro de un pez cebra adulto. Este método ayuda a obtener neuorosferas enteras derivadas del cerebro que se pueden estudiar más a fondo.

Protocol

1. Disección del cerebro adulto del pez cebra

1. Prepare un lecho de disección llenando una placa Petri de 100 mm x 15 mm con paquetes de hielo en gel. A continuación, coloque la tapa de la placa de Petri e incuba a -20 °C hasta que el gel se congele. En la parte superior de la tapa coloque un cuadrado de papel de filtro limpio y envuelva el papel filtrante y la placa de Petri con película de plástico.
2. Limpie y esterilizar todos los instrumentos de microdisección en un 70% de etanol o calor antes de cada uso. Coloque todos los instrumentos de disección esterilizados cerca del microscopio diseccionador y, justo antes de la eutanasia, coloque el lecho de disección debajo del microscopio con iluminación de fibra óptica.
3. Recoger 2 peces cebra adultos para una preparación de neurosfera cerebral entera; y de 3 a 4 peces cebra para generar neuroesferas a partir de regiones cerebrales diseccionadas.
4. Eutanasia el pez cebra adulto (8-12 meses de edad) utilizando un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. A continuación, sumerja el pescado en un 75% de etanol durante 5-10 s y colóquelo rápidamente en el lecho de disección seguido de decapitación a la altura de las branquias usando una cuchilla quirúrgica.
   1. Para eutanasiar animales, administrar una sobredosis (300 mg/L) de metanoesulfonato de tricaina hasta que el latido del corazón del animal se ralentice gradualmente y la circulación se detenga, luego sumergirse en agua helada.
5. Gire el lado dorsal de la cabeza hacia abajo, y usando las tijeras hacer un corte longitudinal desde el lado cortado hasta la boca. El uso de las fórceps expone la base del cráneo y elimina todo el tejido adyacente. Corte las paredes laterales del cráneo desde el principio de la médula espinal hacia el tectum.
6. Usando las tijeras, corta y elimina los nervios ópticos y luego retira ambos lados de la parte más lateral del cráneo a la altura del tectum. Gire el lado ventral de la cabeza hacia arriba. Usando fórceps, despega el resto de la parte más apical del cráneo.
7. Transfiera el cerebro junto con la parte restante del cráneo a un nuevo plato con el medio de disección (DMEM/F12 con Penicilina /Streptomicina). Limpie el tejido cerebral en el medio de disección usando el mango de plástico del micro cuchillo, manteniendo todas las estructuras cerebrales intactas.
8. A partir de este punto, continúe el protocolo utilizando todo el cerebro del pez cebra.
   1. Alternativamente adaptar este protocolo a regiones cerebrales específicas para generar neuroesferas de cerebro de pez cebra entero o del telencéfalo, tectum/diencephalon o cerebelo diseccionado con un bisturí fresco. Utilice una línea transgénica neuronal de pez cebra fluorescente específica neuronal para diseccionar la región cerebral de interés según la Figura 1.

Representative Results

Figura 1: Diferenciación de las neurosferas derivadas del cerebro del pez cebra. (A-C, E) Imágenes de contraste de fase de neuroesferas enteras derivadas del cerebro cultivadas en el medio de diferenciación Z durante 1(A,DiVd1), 3(B,DiVd3) y 4(C y D,DiVd4) días. (E) Vista dorsal de todo el cerebro de un pez cebra Tg(GFAP:DsRed) de 12 meses de edad. El telencéfalo (Tel), el tectum (Tec) y el cerebelo (Cer) fueron diseccionados y recogidos como se muestra. (D) Imágenes de neurosferas DiVd4 derivadas del tectum, telencéfalo y cerebelo en el Pasaje 0 (P0), 1 (P1) y 2 (P2). Barra de escala: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml