Zebrafiskhjärneksektion: En teknik för fiskneurobiologi

Overview

Denna video beskriver tekniken för mikrodissekering av hjärnan från en vuxen zebrafisk. Denna metod hjälper till att erhålla hela hjärnan härledda neuorosfärer som kan studeras vidare.

Protocol

1. Dissekering av den vuxna zebrafiskhjärnan

1. Förbered en dissekeringsbädd genom att fylla en 100 mm x 15 mm petriskål med gelispaket. Lägg sedan locket på petriskålen och inkubera vid -20 °C tills gelén fryser. Ovanpå locket placera en kvadrat av rent filterpapper och linda in både filterpapperet och petriskålen med plastfilm.
2. Rengör och sterilisera alla mikrodissektionsinstrument med 70 % etanol eller värme före varje användning. Placera alla steriliserade dissektionsinstrument nära det dissekerande mikroskopet och placera dissektionsbädden under mikroskopet med optisk fiberbelysning precis före dödshjälp.
3. Samla 2 vuxna zebrafisk för en hel hjärna neurosfär förberedelse; och 3 till 4 zebrafisk för att generera neurosfärer från dissekerade hjärnregioner.
4. Avliva vuxna zebrafiskar (8-12 månader gamla) med hjälp av ett protokoll som godkänts av institutional animal care and use committee. Doppa sedan fisken i 75% etanol i 5-10 sek och placera snabbt i dissekeringsbädden följt av halshuggning på gälarnas nivå med hjälp av ett kirurgiskt blad.
   1. För att avliva djur, administrera en överdos (300 mg/L) trikainmetansulfonat tills djurets hjärtslag gradvis saktar ner och cirkulationen stannar och doppar sedan i isvatten.
5. Vrid ner huvuddrornas sida och använd saxen och gör ett längsgående snitt från den skurna sidan till munnen. Använd tången exponera basen av skallen och ta bort all intilliggande vävnad. Skär skallens laterala väggar från början av ryggmärgen mot tectum.
6. Använd saxen, skär och ta bort de optiska nerverna och ta sedan bort båda sidorna av den mest laterala delen av skallen i nivå med tectum. Vrid upp huvud ventrala sidan. Använd tång, skala av resten av den mest apatiska delen av skallen.
7. Överför hjärnan tillsammans med den återstående delen av skallen till en ny maträtt med dissekeringsmediet (DMEM/F12 med Penicillin /Streptomycin). Rengör hjärnvävnaden i dissekeringsmediet med mikroknivens plasthandtag och håll alla hjärnstrukturer intakta.
8. Från och med nu, fortsätt protokollet med hela zebrafiskhjärnan.
   1. Alternativt anpassa detta protokoll till specifika hjärnregioner för att generera neurosfärer från hela zebrafiskhjärnan eller från telencefalon, tectum/diencephalon eller lillhjärna dissekerad med en färsk skalpell. Använd en neural specifik fluorescerande zebrafisk neural transgen linje för att dissekera hjärnans region av intresse enligt figur 1.

Representative Results

Figur 1: Differentiering av zebrafiskhjärnbaserade neurosfärer. A-C, E) Faskontrastbilder av hela hjärnbaserade neurosfärer odlade i Z-differentieringsmediet under 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) och 4 (C och D, DiVd4) dagar. (E) Dorsal vy över hela hjärnan hos en 12 månader gammal Tg (GFAP:DsRed) zebrafisk. Telencephalon (Tel), tectum (Tec) och lillhjärnan (Cer) dissekerades och samlades in som visas. (D) Bilder av DiVd4 neurosfärer som härrör från tectum, telencephalon och lillhjärnan vid passage 0 (P0), 1 (P1) och 2 (P2). Skalstång: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml