Zebrafisk Hjerne dissektion: En teknik af Fisk Neurobiologi

Overview

Denne video beskriver teknikken med mikrodissection af hjernen fra en voksen zebrafisk. Denne metode hjælper med at opnå hele hjernen afledte neuorosfærer, der kan studeres yderligere.

Protocol

1. Dissektion af den voksne zebrafiskhjerne

1. Forbered en dissektionsseng ved at fylde en 100 mm x 15 mm petriskål med gelisposer. Læg derefter låget på petriskålen og inkuber ved -20 °C, indtil gelen fryser. På toppen af låget placeres en firkant af rent filterpapir og ombrydes både filterpapir og petriskål med plastfolie.
2. Rengør og steriliser alle mikrodissection instrumenter med 70% ethanol eller varme før hver brug. Placer alle steriliserede dissektionsinstrumenter i nærheden af dissekerende mikroskop, og lige før aktiv dødshjælp skal du placere dissektionssengen under mikroskopet med optisk fiberbelysning.
3. Saml 2 voksne zebrafisk til en hel hjerne neurosfære forberedelse; og 3 til 4 zebrafisk til at generere neurosfærer fra dissekerede hjerneområder.
4. Aflive voksne zebrafisk (8-12 måneder gammel) ved hjælp af en protokol godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee. Derefter nedsænkes fisken i 75% ethanol i 5-10 sek og placeres hurtigt i dissektionssengen efterfulgt af halshugning på niveauet af gællerne ved hjælp af et kirurgisk blad.
   1. For at aflive dyr, administrere en overdosis (300 mg / L) af tricain metansulfonat, indtil dyrets hjerte-beat gradvist bremser og omsætning stopper, så nedsænkes i isvand.
5. Drej hovedet dorsale side ned, og ved hjælp af saks gøre en langsgående snit fra den afskårne side til munden. Brug af pincet udsætte bunden af kraniet og fjerne alle de tilstødende væv. Skær kraniets sidevægge fra begyndelsen af rygmarven mod tectum.
6. Brug saksen, skær og fjern synsnerven og fjern derefter begge sider af den mest laterale del af kraniet på tectum-niveau. Vend hovedet ventral side op. Brug pincet, skræl resten af den mest apikale del af kraniet.
7. Overfør hjernen sammen med den resterende del af kraniet til en ny skål med dissektionsmediet (DMEM/F12 med Penicillin /Streptomycin). Rengør hjernevævet i dissektionsmediet ved hjælp af mikroknivens plastikhåndtag, og hold alle hjernestrukturer intakte.
8. Fra dette punkt, fortsætte protokollen ved hjælp af hele zebrafisk hjernen.
   1. Alternativt kan du tilpasse denne protokol til specifikke hjerneområder for at generere neurosfærer fra hele zebrafiskhjernen eller fra telencephalon, tectum/ diencephalon eller cerebellum dissekeret med en frisk skalpel. Brug en neural specifik fluorescerende zebrafisk neurale transgene linje til at dissekere hjernen region af interesse i henhold til figur 1.

Representative Results

Figur 1: Differentiering af zebrafisk hjerne-afledte neurosfærer. (A-C, E) Fasekontrastbilleder af hele hjerne-afledte neurosfærer dyrket i Z-differentieringsmediet i løbet af 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) og 4 (C og D, DiVd4) dage. (E) Dorsal opfattelse af hele hjernen af en 12 måneder gammel Tg (GFAP: DSRed) zebrafisk. Telencephalon (Tel), tectum (Tec) og cerebellum (Cer) blev dissekeret og indsamlet som vist. d) Billeder af DiVd4-neurosfærer fremstillet af tectum, telencephalon og cerebellum ved passage 0 (P0), 1 (P1) og 2 (P2). Skalastang: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml