Bc-cellen co-cultiveren: borstkankercellen cultiveren met botfragmenten om de proliferatie van kankercellen te bestuderen

Overview

Deze video beschrijft de cultivering van borstkankercellen naast dijbeen explants om de proliferatie en kolonisatie van kankercellen in een menselijk botweefsel explant modelsysteem te meten.

Protocol

1. Co-cultiveren van borstkankercellen naast botfragmenten om de proliferatie van borstcellen te meten met behulp van BLI

1. Bereid voorafgaand aan het experiment een suspensie voor met 2 x 10⁵ borstkankercellen/50 μl en bereid pluggen van botwas voor om botfragmenten in cultuur te immobiliseren. Snijd een P200 micropipette tip in 3 stukken en gebruik het smalle uiteinde van het grootste stuk op een "cookie cutter" manier om kleine (~35 mg) stukjes botwas te snijden. Gebruik het brede uiteinde van het kleinste stuk om de botwaspluggen in een Petrischaal uit te werpen voor opslag.
2. Plaats een stuk beenderwas op de 12 uur positie van elke put en druk voorzichtig naar beneden met een steriele wijsvinger.
3. Pipet 50 μl celsuspensie met 1 x 10⁵ borstkankercellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in het midden van elke put van een 6-put plaat. (Als alternatief, zaadcellen in een gedispergeerd patroon indien gewenst.) Plaats de plaat gedurende 45 minuten in een weefselkweek-incubator van 37 °C om de celaanhechting te bevorderen.
4. Plaats 1 botfragment op 1 stuk botwas voor elke experimentele put en oefen zachte druk uit met de rongeur om het vast te zetten. Voer experimenten uit in drievoud, zodat 3 botfragmenten van een bepaald THR-monster in de bovenste drie putten worden geplaatst, terwijl de onderste drie putten alleen botwas als controles bevatten.
5. Lever met behulp van een pipet van 5 ml voorzichtig en langzaam 5 ml DMEM-10% FBS aan de zijkant van elke put om te voorkomen dat de borstcellen of botfragmenten loskomen. Plaats de plaat 20-24 uur in een weefselkweek-incubator van 37 °C.
6. Om bioluminescentiebeeldvorming (BLI) uit te voeren, verwijdert u de plaat uit de incubator en voegt u luciferinesubstraat (om een concentratie van 300 μg/ml te bereiken) toe aan elke put. Stel de plaat onmiddellijk in beeld op een IVIS Imaging Platform met behulp van de volgende parameters: f-stop van 1, kleine binning, belichtingstijd van 1 sec, niveau D. Meet de signaalintensiteit van elke en gemiddelde straling (fotonen/seconde/vierkante centimeter/steradian).
7. Gebruik beeldvormingssoftware om de ROI (Regions of Interest) te definiëren om de gemiddelde uitstraling voor alle experimentele en besturingsputten te kwantificeren. Exporteer gemiddelde uitstralingswaarden naar een Excel-blad om statistieken uit te voeren en grafieken te genereren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26