BC Hücrelerini Birlikte Kültleme: Kanser Hücresi Çoğalmasını İncelemek İçin Meme Kanseri Hücrelerini Kemik Parçalarıyla Kültleme

Overview

Bu video, bir insan kemik dokusu eksplant model sisteminde kanser hücresi çoğalmasını ve kolonizasyonunu ölçmek için femur kemik eksplantlarına bitişik meme kanseri hücrelerinin kültleşmesini açıklamaktadır.

Protocol

1. BLI Kullanarak Meme Hücresi Çoğalmasını Ölçmek için Kemik Parçalarına Bitişik Meme Kanseri Hücrelerini Birlikte Kültleme

1. Deneyden önce, 2 x 10 5 meme kanseri hücresi/⁵⁰ μl içeren bir süspansiyon hazırlayın ve kültürde kemik parçalarını hareketsizleştirmek için kemik balmumu tıkaçları hazırlayın. Bir P200 mikropipette ucunu 3 parçaya bölün ve en büyük parçanın dar ucunu küçük (~35 mg) kemik balmumu parçalarını kesmek için "kurabiye kesici" bir şekilde kullanın. Kemik balmumu fişlerini depolama için bir Petri kabına çıkarmak için en küçük parçanın geniş ucunu kullanın.
2. Her kuyunun saat 12 pozisyonunda bir parça kemik cilası yerleştirin ve steril eldivenli bir işaret parmağıyla hafifçe bastırın.
3. Pipet 50 μl hücre süspansiyon içeren 1 x 10⁵ meme kanseri hücreleri DMEM-10% FBS + Pen-Strep her kuyunun merkezinde 6 kuyulu bir plaka. (Alternatif olarak, istenirse dağınık bir desendeki tohum hücreleri.) Hücre bağlanmasını teşvik etmek için plakayı 45 dakika boyunca 37 °C doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
4. Her deneysel kuyu için 1 parça kemik balmumu üzerine 1 kemik parçası yerleştirin ve sabitlemek için rongeur ile hafif basınç uygulayın. Üçlemede deneyler yapın, böylece belirli bir THR örneğinden 3 kemik parçası ilk üç kuyuya yerleştirilirken, alt üç kuyu sadece kontrol olarak kemik balmumu içerir.
5. 5 ml pipet kullanarak, meme hücrelerinin veya kemik parçalarının yerinden olmasını önlemek için her kuyunun yanına nazikçe ve yavaşça 5 ml DMEM-% 10 FBS teslim edin. Plakayı 20-24 saat boyunca 37 °C doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
6. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) yapmak için plakayı inkübatörden çıkarın ve her kuyuya luciferin substratı (300 μg / ml konsantrasyon elde etmek için) ekleyin. Plakayı aşağıdaki parametreleri kullanarak hemen bir IVIS Görüntüleme Platformuna görüntüleyin: f-stop of 1, small binning, exposure time of 1 sn, level D. Her birinin sinyal yoğunluğunu ve ortalama parlaklığı (fotonlar/saniye/santimetre/steradian) ölçün.
7. Tüm deneysel ve kontrol kuyularının ortalama parlaklığını değerlendirmek üzere İlgi Alanları 'nı (ROI) tanımlamak için görüntüleme yazılımını kullanın. İstatistikleri gerçekleştirmek ve grafikler oluşturmak için ortalama parlaklık değerlerini excel sayfasına verin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26