Overview
וידאו זה מתאר את culturing של תאים סרטניים בשד סמוך עצם הירך explants כדי למדוד התפשטות תאים סרטניים קולוניזציה במערכת מודל explant רקמת העצם האנושית.
Protocol
1. שיתוף culturing סרטן השד תאים סמוכים שברי העצם כדי למדוד את התפשטות תאי השד באמצעות BLI
- לפני הניסוי, להכין השעיה המכילה 2 x 105 תאים סרטניים בשד / 50 μl, ולהכין תקעים של שעווה בעצמות עבור שברי עצם משתקת בתרבות. חותכים קצה מיקרופיפט P200 לתוך 3 חתיכות ולהשתמש בקצה הצר של היצירה הגדולה ביותר באופן "חותך עוגיות" לחתוך קטן (~ 35 מ"ג) חתיכות של שעווה בעצמות. השתמש בקצה הרחב של החתיכה הקטנה ביותר כדי לפלוט את תקעי שעווה העצם לתוך צלחת פטרי לאחסון.
- מניחים חתיכת שעווה בעצמות במיקום השעה 12 של כל באר ולחץ בעדינות כלפי מטה עם אצבע המורה כפפות סטריליות.
- פיפטה 50 μl של השעיית תאים המכיל 1 x 105 תאים סרטניים בשד ב DMEM-10% FBS + עט סטרפטוקוקוס במרכז כל באר של צלחת 6-well. (לחלופין, יש לזרוע תאים בתבנית מפוזרת במידת הצורך). מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי לקדם את החיבור לתא.
- מניחים שבר עצם אחד על 1 חתיכת שעווה עצם עבור כל באר ניסיוני ולהפעיל לחץ עדין עם rongeur כדי לאבטח אותו. לבצע ניסויים משולשים כך 3 שברי עצם מדגם THR נתון ממוקמים לתוך שלוש בארות העליון, בעוד שלוש בארות התחתון מכילים שעווה בעצמות רק כמו פקדים.
- באמצעות פיפטה 5 מ"ל, בעדינות ולאט לאט לספק 5 מ"ל של DMEM-10% FBS לצד של כל באר, כדי למנוע עקירת תאי השד או שברי העצם. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות.
- כדי לבצע הדמיה bioluminescence (BLI) להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף מצע לוציפרין (כדי להשיג ריכוז של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל באר. תמונה את הצלחת מיד על פלטפורמת הדמיה IVIS באמצעות הפרמטרים הבאים: f-stop של 1, binning קטן, זמן החשיפה של 1 שניות, רמה D. למדוד את עוצמת האות של כל אחד גם זוהר ממוצע (פוטונים / שני / סנטימטר מרובע / steradian).
- השתמש בתוכנת דימות כדי להגדיר אזורי עניין (ROI) כדי לכמת את הזוהר הממוצע עבור כל בארות הניסוי והבקרה. יצא ערכי זוהר ממוצעים לגליון Excel כדי לבצע סטטיסטיקה וליצור גרפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 |
