Biology

कैसे संस्कृति रिकार्ड, और माइक्रो इलेक्ट्रोड Arrays पर neuronal नेटवर्क उत्तेजित (meas)

Published: May 30, 2010 doi: 10.3791/2056

Chadwick M. Hales^1,2, John D. Rolston^2,3, Steve M. Potter²

¹Department of Neurology, Emory University School of Medicine, ²Coulter Department of Biomedical Engineering, Laboratory for Neuroengineering, Georgia Institute of Technology and Emory, University School of Medicine, ³Emory University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल स्थापना, देखभाल के लिए, से रिकॉर्डिंग और विद्युत meas पर संस्कृतियों उत्तेजक के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है.

Abstract

पिछली सदी के लिए, दुनिया भर के कई neuroscientists समझ कैसे neuronal नेटवर्क काम करने के लिए अपने जीवन समर्पित कर दिया है और वे विभिन्न रोगों में क्यों काम करना बंद. अध्ययन neuropathological अवलोकन, आनुवंशिक लेबलिंग के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, और दोनों अलग न्यूरॉन्स और टुकड़ा तैयारी में intracellular रिकॉर्डिंग भी शामिल है. इस प्रोटोकॉल के एक अन्य प्रौद्योगिकी है, जो सूक्ष्म इलेक्ट्रोड arrays (भी बुलाया बहु इलेक्ट्रोड सरणियाँ, meas) पर अलग neuronal संस्कृतियों बढ़ रही शामिल चर्चा.

अन्य प्रौद्योगिकियों पर इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं. Meas पर dissociated neuronal संस्कृतियों एक सरलीकृत मॉडल में जो नेटवर्क गतिविधि सरणी एकाधिक इलेक्ट्रोड के माध्यम से बिजली की उत्तेजना के दृश्यों के साथ चालाकी से किया जा सकता है प्रदान करते हैं. क्योंकि नेटवर्क छोटा है, उत्तेजना के प्रभाव नमूदार क्षेत्रों, जो बरकरार तैयारी में मामला नहीं है तक सीमित है. कोशिकाओं आकारिकी आसान में परिवर्तन बनाने के लिए विभिन्न इमेजिंग तकनीक के साथ निगरानी monolayer में बढ़ता है. अंत में, meas पर संस्कृतियों के लिए इन विट्रो में एक वर्ष है जो कोई स्पष्ट समय अन्य संवर्धन तकनीक के साथ निहित सीमाओं को हटा ^से अधिक जीवित रहने के एक कर सकते हैं.

हमारे और विश्व भर में प्रयोगशाला दूसरों को इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं neuronal नेटवर्क के बारे में महत्वपूर्ण सवाल पूछने. इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए स्थापना की देखभाल, से रिकॉर्डिंग और विद्युत meas पर संस्कृतियों उत्तेजक के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करना है इन विट्रो नेटवर्क में नेटवर्क पर physiologically प्रासंगिक सवाल पूछ रहा है और एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी सेलुलर स्तर के लिए एक साधन प्रदान करते हैं. मस्तिष्क समारोह और रोग.

Protocol

ए परिचय

मानव मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की अरबों रहे हैं. इन न्यूरॉन्स के प्रत्येक कनेक्शन के हजारों के लिए कई अलग अलग कोशिकाओं के साथ सैकड़ों बार बार हो सकता है. ये कनेक्शन का संकेत है कि हमें चलना, एक पियानो खेलने के लिए, एक साइकिल की सवारी, हँसते हैं, रोना, और याद अनुमति बंदरगाह. पिछली सदी के लिए, दुनिया भर के कई neuroscientists समझ कैसे neuronal नेटवर्क काम करने के लिए अपने जीवन समर्पित कर दिया है और वे विभिन्न रोगों में क्यों काम करना बंद.

वहाँ कई उपकरण एक उपयोग कर सकते हैं जब यह प्रतीत होता है दुर्गम काम पर ले रहे हैं. प्रारंभिक अध्ययन कैसे मानव और अन्य जानवरों के दिमाग में तंत्रिका सर्किट का आयोजन कर रहे हैं neuropathological अवलोकन पर ध्यान केंद्रित किया गया. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक लेबलिंग के आगमन के इन संरचनात्मक प्रोटीन और डीएनए के स्तर तक नीचे सेलुलर संरचना की खोज के अध्ययन के दायरे का विस्तार किया.

लेकिन इन प्रयोगों मस्तिष्क के गतिशील समारोह का पता नहीं था, केवल स्थिर व्यवस्था है. चल रहे तंत्रिका गतिविधि को समझने के लिए, लोकप्रिय तकनीक आम तौर पर intracellular रिकॉर्डिंग के साथ electrophysiological गतिविधि की जांच पर ध्यान केंद्रित. अलग संस्कृतियों के एकल न्यूरॉन्स एक उपयोगी न्यूनकारी मॉडल है, लेकिन इस तकनीक एकल कक्षों से रिकॉर्डिंग के लिए कम समय के अंतराल के द्वारा सीमित है प्रदान करते हैं. यह मॉडल भी नेटवर्क में अन्य कक्षों के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करता है. कृन्तकों से मस्तिष्क स्लाइसें जहां cortical वास्तुकला बनाए रखा है एक यथार्थवादी मॉडल के अधिक प्रदान करते हैं. लेकिन इस तरह की स्लाइस, यहाँ तक कि जब सुसंस्कृत, एक सीमित जीवन काल है और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकते ^हैं जिंदा रखने जबकि 2 cytoarchitecture को बनाए रखना है.

एक अन्य तकनीक सूक्ष्म इलेक्ट्रोड arrays (भी बुलाया बहु इलेक्ट्रोड सरणियाँ, meas) पर बढ़ती dissociated neuronal संस्कृतियों शामिल है. न्यूरॉन्स meas जो डिश के तल में microelectrodes एम्बेडेड है पर चढ़ाया जाता है. तीन सप्ताह के दौरान, इन संस्कृतियों axons dendrites, और synaptic कनेक्शन के हजारों नहीं तो सैकड़ों के साथ पूरा न्यूरॉन्स के नेटवर्क के रूप में. अन्य प्रौद्योगिकियों पर इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं. Meas पर dissociated neuronal संस्कृतियों को एक सरल मॉडल के साथ जो काम करने के लिए (एक एकल cortical स्तंभ के क्रम के बजाय एक अक्षुण्ण मस्तिष्क पर) प्रदान करते हैं. कोशिकाओं आकारिकी आसान में परिवर्तन बनाने के लिए विभिन्न इमेजिंग तकनीक के साथ निगरानी monolayer में बढ़ता है. नेटवर्क गतिविधि सरणी एकाधिक इलेक्ट्रोड के माध्यम से बिजली की उत्तेजना के दृश्यों के साथ चालाकी से किया जा सकता है. क्योंकि नेटवर्क छोटा है, उत्तेजना के प्रभाव नमूदार क्षेत्रों, जो बरकरार तैयारी में मामला नहीं है तक सीमित है. अंत में, meas पर संस्कृतियों के लिए इन विट्रो में एक वर्ष है जो कोई स्पष्ट समय अन्य संवर्धन तकनीक के साथ निहित सीमाओं को हटा ^से अधिक जीवित रहने 1 इसलिए कर सकते हैं. Meas पर संस्कृतियों neuronal कनेक्टिविटी के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं.

हमारे और विश्व भर में प्रयोगशाला दूसरों को इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं neuronal नेटवर्क के बारे में महत्वपूर्ण सवाल पूछने. वर्तमान neuronal इस मॉडल के साथ अध्ययन किया जा रहा है प्रक्रियाओं नेटवर्क गतिशीलता, विकास, सीखने और स्मृति, synaptic plasticity, excitotoxicity, ischemia और neurodegeneration ^में शामिल इन अध्ययनों से 3-10 निष्कर्ष जन्मजात malformations जैसे मानव रोग, मिरगी के लिए बेहतर उपचार की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है. , स्ट्रोक और अल्जाइमर रोग. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्थापना की देखभाल, से रिकॉर्डिंग और meas पर संस्कृतियों उत्तेजक के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करना है. अंतिम लक्ष्य के लिए शोधकर्ताओं और सेलुलर नेटवर्क का स्तर है कि शायद मस्तिष्क समारोह और रोग का एक बेहतर समझ के लिए और अंततः कि हमारे न्यूरॉन्स और कैसे वे संवाद को प्रभावित रोगों के उपचार नेतृत्व कर सकते हैं physiologically प्रासंगिक सवाल पूछने के लिए एक साधन प्रदान करना है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के संवर्धन में हमारी प्रयोगशाला से अनुभव के 10 साल से अधिक का प्रतिनिधित्व करता है, से रिकॉर्डिंग और सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों पर neuronal नेटवर्क उत्तेजक. हर कदम को इतनी के रूप में लंबे समय से स्वस्थ neuronal नेटवर्क जीवित के विकास के लिए नेतृत्व करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. संदर्भ है जहाँ उपलब्ध है, जबकि कुछ इष्टतम सेटिंग्स हम empirically निर्धारित प्रदान की जाती हैं. प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले, उपकरण और आपूर्ति प्राप्त करने और समाधान के रूप में हकदार अनुभाग में सूचीबद्ध 'माल तैयार.' 'ब्रेन विच्छेदन' पर अनुभाग संक्षिप्त चर्चा की जाएगी लेकिन साथ वीडियो कल्पना प्रयोग लेख के अन्य जर्नल के रूप में इस ¹¹ विषय को कवर में प्रदर्शन नहीं .

बी मस्तिष्क विच्छेदन

पूरे दिमाग भ्रूण 18 दिन (E18) चूहों से निकाले जाते हैं. समय गर्भवती मादा चूहों साँस isoflurane और decapitated के साथ anesthetized हैं. भ्रूण हटा रहे हैं और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद Guid अनुसार dissectedप्रयोगशाला Emory विश्वविद्यालय IACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए ए.
हालांकि सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग, भ्रूण दिमाग हटा रहे हैं और ठंड हांक एक 100 मिमी बाँझ पेट्री डिश में बैलेंस्ड साल्ट समाधान (HBSS) में रखा. विच्छेदन प्रोटोकॉल के शेष एक लामिना का प्रवाह हुड में एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत होता है प्रदूषण के लिए जोखिम को कम करने के लिए.
चूहे के दिमाग एक समय में एक विच्छेदन के लिए HBSS के साथ एक दूसरे बाँझ पेट्री डिश को हस्तांतरित कर रहे हैं. HBSS में जलमग्न brainstem thalamus, और सेरिबैलम दूर काट रहे हैं और गोलार्द्धों bisected है.
घ्राण tubercle जबकि धीरे meninges हटाने गोलार्द्ध हासिल करने के लिए संभाल के रूप में उपयोग किया जाता है.
प्रांतस्था तो अंतर्निहित हिप्पोकैम्पस और striatum से दूर खुली और सीतनिद्रा में होना समाधान में बर्फ पर एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में संग्रहीत ¹² के बाद से वहाँ आमतौर पर एकाधिक भ्रूण रहे हैं, इस प्रक्रिया को फिर दोहराया है meas के वांछित संख्या के आधार पर चढ़ाया जा और वांछित सेल घनत्व. Cortices सेल पृथक्करण की प्रक्रिया के लिए संयुक्त रहे हैं नीचे के रूप में चर्चा की. Cortices 4 में संग्रहीत किया जा सकता ° सी सीतनिद्रा में होना समाधान में 24 घंटे से पहले हदबंदी केवल सेल व्यवहार्यता के न्यूनतम क्षति के साथ के लिए. ऊतक घर में dissected उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में, मस्तिष्क के ऊतकों dissected ब्रेन बिट्स (से खरीद किया जा सकता है www.brainbitsllc.com ).

सी. विदेश मंत्रालय तैयारी और cortical हदबंदी

Meas ALA (वैज्ञानिक से प्राप्त कर रहे हैं www.alascience.com ), निर्माता, मल्टी चैनल सिस्टम के लिए एक विक्रेता . इलेक्ट्रोड अभिविन्यास और रिक्ति, उपस्थिति या एक आंतरिक जमीन इलेक्ट्रोड उपस्थिति, या एक गिलास की अंगूठी के अभाव के अभाव, और कांच की अंगूठी के आकार में बदलाव के साथ meas के लिए कई अलग अलग विन्यास कर रहे हैं. हमारे बुनियादी प्रयोगों के लिए हम मानक सूक्ष्म इलेक्ट्रोड एक 8 में 8 एक छोटे कांच की अंगूठी के साथ एक ग्रिड व्यवस्था द्वारा 60 इलेक्ट्रोड युक्त सरणी का उपयोग करें. टाइटेनियम नाइट्राइड इलेक्ट्रोड व्यास 30 सुक्ष्ममापी और इलेक्ट्रोड केन्द्रों के बीच की दूरी 200 सुक्ष्ममापी है. इलेक्ट्रोड के एक बड़े और जमीन या आंतरिक संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य है. जब meas से निपटने, यह vitally महत्वपूर्ण है कि कोई ठोस वस्तुओं (जैसे, विंदुक युक्तियाँ, पेपर ऊतकों, या रबर पुलिसकर्मियों) कभी पकवान के अंदर स्पर्श के रूप में इस इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है. Meas और हैंडलिंग के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी विदेश मंत्रालय के उपयोगकर्ता पुस्तिका (में पाया जा सकता है है / www.multichannelsystems.com उत्पादों विदेश मंत्रालय / microelectrode - arrays.html).
सेल तैयारी से पहले शाम को, meas de-ionized पानी के साथ rinsed हैं और फिर 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में सोख करने की अनुमति दी. व्यंजन तो रातोंरात पर यूवी प्रकाश के साथ कर रहे हैं एक लामिना का प्रवाह हुड में रखा. से निपटने के प्रयोजनों के लिए, प्रत्येक विदेश मंत्रालय के एक मानक 100 मिमी दिनांक और पेट्री डिश पर रखा लेबलिंग के साथ बाँझ polystyrene पेट्री डिश में रखा गया है. ध्यान से, autoclaving और 90 में पानी का उपयोग सहित अन्य नसबंदी तकनीकों डिग्री सेल्सियस विदेश मंत्रालय उपयोगकर्ताओं पुस्तिका में उल्लेख कर रहे हैं. हालांकि, हम empirically पाया है कि autoclaving बार है कि एक विदेश मंत्रालय में इस्तेमाल किया जा सकता है की संख्या में कमी लगती है. यदि आप meas पुन: उपयोग कर रहे हैं कि वर्तमान संस्कृतियों है, तो कार्बनिक पदार्थ हटा दिया जाना चाहिए. पीबीएस में 0.25% की trypsin 300-400 μl विदेश मंत्रालय पर 35-37 ° सी में 20 मिनट के लिए incubated है. विदेश मंत्रालय de-ionized पानी के साथ rinsed है और उसके बाद एक रोशनी खुर्दबीन के साथ निरीक्षण किया. यदि सेलुलर बात अभी भी बनी हुई है, तो trypsin कदम साफ जब तक दोहराया है. यदि पकवान साफ है, तो ऊपर के रूप में नसबंदी कदम के साथ आगे बढ़ना. सामान्य में, meas उचित देखभाल के साथ कई बार reused किया जा सकता है.
इसके अलावा शाम को पहले चढ़ाना, विदेश मंत्रालय के lids के लिए तैयार कर रहे हैं और autoclaved. lids बनाई गई कस्टम हैं, लेकिन ALA - वैज्ञानिक से भी खरीदा जा सकता है. वे polytetrafluoroethylene Teflon के बने होते हैं और एक स्पष्ट (fluorinated Teflon ईथीलीन-propylene) झिल्ली शीर्ष भर में फैला है. झिल्ली गैसों के प्रसार की अनुमति देता है, लेकिन पानी के प्रसार जिससे सीमा लगभग एक humidified वातावरण के लिए नष्ट करने की जरूरत है और वाष्पीकरण और hyperosmolarity ^के हानिकारक प्रभाव को रोकने 1.
एक बार ऊपर विच्छेदन पूरा हो गया है, विदेश मंत्रालय तैयारी polyethyleneimine समाधान (पी) के प्रत्येक विदेश मंत्रालय के केंद्र में 100 μl रखकर जारी रखा है हमारे हाथों ^में 13., पी polylysine का उपयोग कर से विदेश मंत्रालय में कोशिकाओं के कम क्लस्टरिंग समाधान प्रदान करता है . पकवान लामिना का प्रवाह हुड में हल्के meas पर आराम करने वाष्पीकरण को रोकने के lids के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दी है. एक अनुस्मारक के रूप में, एक मानक सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड में खुला विदेश मंत्रालय या मस्तिष्क के ऊतकों के साथ किसी भी काम जगह मिनी लेना चाहिएसंदूषण का जोखिम Mize.
विदेश मंत्रालय तो बाँझ de-ionized पानी के 1-2 मिलीलीटर के साथ 3 बार rinsed. आदर्श लामिना का प्रवाह हुड सेट अप व्यंजनों से तरल पदार्थ को हटाने के लिए एक Aspirator तंत्र शामिल होंगे. एक बाँझ 200μl विंदुक टिप Aspirator टयूबिंग के लिए संलग्न किया जा सकता है. विदेश मंत्रालय की सतह को छूने के रूप में इस इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है जबकि aspirating मत करो. कुल्ला अंतिम के बाद, विदेश मंत्रालय लामिना का प्रवाह हुड में कम से कम 30 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दी है.
इस अवधि के दौरान सुखाने, neuronal पृथक्करण की प्रक्रिया papain समाधान के 2 मिलीलीटर में एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार प्लास्टिक शीशी में cortices रखकर शुरू कर दिया है ¹ DNase के 50 μl मिश्रण को जोड़ा जाता है. शीशी एक पानी के स्नान में 35-37 ° सी में रखा गया है और लगभग 20 मिनट के लिए incubated. धीरे समाधान बुलबुले शुरू से बचने के लिए सावधान किया जा रहा मिश्रण के लिए हर 5 मिनट नल. cortices पाचन आय के रूप में एक फजी उपस्थिति पर लेने के लिए शुरू करना चाहिए.
papain समाधान तो ध्यान 15ml शंक्वाकार शीशी में cortices छोड़ने pipetting द्वारा हटा दिया है. सेल के माध्यम से 2 मिलीलीटर cortices के लिए जोड़ा जाता है, 2-3 मिनट के लिए सेते की अनुमति दी और फिर धीरे से हटा दिया. यह किसी भी अवशिष्ट papain, जो भी माध्यम में सीरम से हिचकते होगा धोने है. सेल के माध्यम से एक अन्य 2ml cortices के लिए जोड़ा जाता है और इस नमूने तो 5-10 सेकंड के लिए उच्च गति पर vortexed है. 15ml शंक्वाकार शीशी के नीचे और कोई शेष मस्तिष्क टुकड़े में एक बादल समाधान होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, 3 बार से 1 मध्यम मिलीलीटर के साथ trituration पी 1000 हाथ से आयोजित पिपेट का उपयोग ऊतक अलग करने के लिए उपयोग किया जा ^सकता है उचित trituration के लिए 1, प्रत्येक विंदुक स्ट्रोक एक दूसरे लेना चाहिए.
समाधान तो एक बाँझ गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से 40μm सेल झरनी के माध्यम से धीरे से गुजारें की अनुमति दी है. धीरे धीरे सेल समाधान एक P-1000 के साथ एक बूंद जोड़ने झरनी में एक समय में. एक 35 मिमी बाँझ पेट्री डिश तनावपूर्ण सेल समाधान इकट्ठा करने के लिए उपयोग किया जाता है.
सेल निलंबन तो एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी वापस स्थानांतरित और सेल मध्यम 4.0 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जोड़ा जाता है. ¹⁴
एक 5% w / ध् BSA समाधान के 500 μl तो ध्यान 15ml शंक्वाकार शीशी के तल में एक P-1000 के साथ ^{स्तरित} 14 इस सेल युक्त शीशी में समाधान ऊपर विस्थापित होंगे .
BSA में नीचे स्तरित के साथ सेल समाधान तो 200 XG पर 6 मिनट के लिए centrifuged छोटे मलबे और संभावित विषाक्त intracellular सामग्री ^{हटाने.} 14
सेल centrifugation कदम के दौरान, meas नेत्रहीन करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे पूरी तरह से सूख रहे हैं मूल्यांकन कर रहे हैं. Laminin समाधान के 20 μl तो सावधानी से कर रहे हैं विदेश मंत्रालय के केंद्र में रखा सुनिश्चित करना है कि इलेक्ट्रोड के सभी कवर ^कर रहे हैं 1 इस समाधान में हवाई बुलबुले शुरू के बाद से है कि इलेक्ट्रोड सतह की अपर्याप्त तैयारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से बचें. यदि विदेश मंत्रालय पूरी तरह से सूखा नहीं है, तो laminin के ड्रॉप पकवान भर में फैल संभावित बनाने इसे और अधिक कठिन पर्याप्त रूप से इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं स्थानीयकरण जब चढ़ाना होगा. यह कदम बहुत ही नाजुक है और एक अस्थिर हाथ के साथ विदेश मंत्रालय के सतह को नुकसान के लिए नेतृत्व के लिए या ध्यान में चूक की क्षमता है.
Teflon lids के विदेश मंत्रालय पर इस बिंदु पर रखा जाता है laminin के वाष्पीकरण को रोकने के. ढकने की नियुक्ति भी नाजुक है. एक ढक्कन या केवल रखा जाना चाहिए हटाया जा जब विदेश मंत्रालय के एक पूरी तरह से फ्लैट सतह पर है. अन्यथा, एक असमान सतह से अतिरिक्त exerted बलों यह बेकार प्रतिपादन सरणी के गिलास नीचे दरार सकता है. पकवान तो 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखा गया है.
Laminin डिश के लिए बाध्य है, जबकि 15 मिलीलीटर शंक्वाकार कोशिकाओं से युक्त शीशी अपकेंद्रित्र से निकाल दिया जाता है और वापस लामिना का प्रवाह हुड तबादला. एक गोली शीशी के नीचे में दिखाई जानी चाहिए. सतह पर तैरनेवाला ध्यान से एक बाँझ 5ml प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ हटा दिया जाता है. सतह पर तैरनेवाला सहेजें मामले में centrifugation प्रक्रिया अधूरा था. गोली फिर P-1000 या सेल मध्यम की उम्मीद की उपज के आधार पर 300-500 μl में एक त्वरित भंवर के साथ trituration से धीरे या तो resuspended. सेल निलंबन के 10 μl निकाल दिया है और एक hemacytometer पर रखा सेल एकाग्रता का निर्धारण. अगर उपज कम है, अगर centrifugation कदम अधूरा था निर्धारित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण. दोहराएँ centrifugation आवश्यक हो सकता है. यदि उपज अधिक है, तो एक कमजोर पड़ने और अधिक सटीक गिनती के लिए आवश्यक हो सकता है. सेल चढ़ाना घनत्व विदेश मंत्रालय के अनुसार 5000 से 300.000 कोशिकाओं को रेंज कर सकते हैं. ताकि चढ़ाना के लिए कक्षों की वांछित संख्या 15-20 μl के अंतिम मात्रा में है एक कमजोर पड़ने की गणना. हम आम तौर पर μl प्रति 1000 से 3000 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें. Cortices की एक जोड़ी आमतौर पर बीच 10 और 15 मिलियन कोशिकाओं निकलेगा. यह संख्या थोड़ी कम हो अगर trituration उपयोग किया जाता है हो सकता है.
इस समय तक टी,वह laminin विदेश मंत्रालय पर ऊष्मायन पूरा किया जाना चाहिए. Teflon ढक्कन विदेश मंत्रालय से हटा दिया है और laminin ड्रॉप के सबसे वैक्यूम से aspirated या दूर pipetted है. फिर वांछित सेल निलंबन के 15-20 μl तुरंत laminin के अवशिष्ट गीला क्षेत्र पर pipetted है. सेल निलंबन की इस छोटी मात्रा में हवा बुलबुले शुरू हवा बुलबुले के रूप में इलेक्ट्रोड के समान रूप से सभी को कवर करने से कोशिकाओं को रोका जा सकता है से बचने के लिए सावधान रहो. ढक्कन धीरे और प्रतिस्थापित किया गया है और विदेश मंत्रालय ध्यान इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए रखा. पकवान तब प्रकाश करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं का पालन किया है और इलेक्ट्रोड के सभी कवर खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण किया है. यदि इलेक्ट्रोड के सभी कवर नहीं कर रहे हैं, तो अधिक कक्षों और जोड़ा जा सकता है विदेश मंत्रालय इनक्यूबेटर में वापस डाल पर ढक्कन के साथ करने के लिए इन नई कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति. यदि सेल निलंबन की एक ट्यूब undisturbed बैठे के बाद एक कुछ मिनट से अधिक प्रयोग किया जाता है, धीरे ज़ुल्फ़ यह बस कोशिकाओं resuspend करने के लिए सुनिश्चित हो. एक बार पर्याप्त इलेक्ट्रोड कवरेज हासिल है, तो पकवान धीरे धीरे गर्म के 1ml (35-37 डिग्री सेल्सियस) सेल मध्यम के साथ पानी भर गया है. Teflon ढक्कन की जगह है और पकवान वापस इनक्यूबेटर में रखा गया है. लामिना का प्रवाह हुड जल्दी छोटे laminin मात्रा और सेल निलंबन मात्रा एक बार विदेश मंत्रालय पर शुष्क कर सकते हैं तो देखभाल करने के लिए उन्हें Teflon lids के साथ सील रखने. सील meas के लिए आदर्श इनक्यूबेटर पर्यावरण 5% सीओ _2, 9% ₂ हे और 65% आर्द्रता 35-37 डिग्री सेल्सियस है कम ऑक्सीजन तनाव दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है, oxidative नुकसान ^को कम करने 12 को बनाए रखने 65% नमी Teflon झिल्ली के माध्यम से वाष्पीकरण कम कर देता है (नहीं आर्द्रता नियंत्रण की तुलना में) और पानी संक्षेपण से क्षति के बिना विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रॉनिक्स इनक्यूबेटर में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है (के रूप में संतृप्ति के लिए एक सामान्य humidified इनक्यूबेटर) के साथ.

डी. सेल मध्यम बदलने और meas पर अलग संस्कृतियों के लिए देखभाल

सेल चढ़ाना के बाद दिन, प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विदेश मंत्रालय का निरीक्षण किया. यदि मध्यम का रंग अभी भी आड़ू लाल रंग में और सेलुलर मलबे और कोशिका मृत्यु का एक सीमित मात्रा में है, तो पहले मध्यम परिवर्तन एक दिन के लिए देरी किया जा सकता है. हालांकि, अगर माध्यम से अधिक नारंगी या पीले रंग और / में दिखाई शुरू कर रहा है या वहाँ सेलुलर मलबे और कोशिका मृत्यु की एक बड़ी राशि है, तो मध्यम बदलने. सभी मध्यम एक मानक सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड में परिवर्तन हो जाना चाहिए.
पहली विदेश मंत्रालय के ढक्कन को हटाने के पकवान में दूर माध्यम के सभी aspirating, ताजा सेल माध्यम से हटा राशि की जगह, और फिर ढक्कन जगह मध्यम परिवर्तन के होते हैं. पहला माध्यम से चढ़ाना प्रक्रिया से किसी भी शेष सेलुलर मलबे को हटाने के परिवर्तन पर सेल के माध्यम से पूरी राशि बदलें. बाद मध्यम परिवर्तन केवल दूर aspirate ताजा माध्यम के साथ हटा राशि की जगह द्वारा पीछा किया माध्यम से लगभग आधा होना चाहिए. यह वृद्धि कारक है कि सेल के माध्यम में secreted किया गया है के लिए एक और अधिक इष्टतम बढ़ते पर्यावरण को बनाए रखने कोशिकाओं के साथ रहने के कुछ की अनुमति देता है. यदि ढक्कन के नीचे मध्यम बदलने की प्रक्रिया के दौरान दूषित है या अगर ढक्कन क्षति या ढीले ढाले के लक्षण दिखाता है, तो एक नई autoclaved ढक्कन का उपयोग. सेल मध्यम एक कस्टम संशोधित ढक्कन के साथ एक बाँझ कंटेनर (है कि एक Teflon (fluorinated ईथीलीन-propylene) गैसीय आदान - प्रदान के लिए अनुमति झिल्ली) में इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जा सकता है. सेल मध्यम भी 4 पर भंडारित किया जा सकता ° सी लेकिन गर्म और इनक्यूबेटर में इस बदलते माध्यम से पहले संतुलित.
निकालें और एक सप्ताह में दो बार के बारे में एक डिश के माध्यम लगभग आधे जगह. कुछ सेल तैयारी मध्यम में और अधिक तेजी से रंग परिवर्तन और अधिक लगातार परिवर्तन के लिए एक की जरूरत के कारण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि मध्यम के लिए पीले रंग के लिए उल्लेख किया है, तो मध्यम की पूरी राशि बदल जाते हैं. पीले करने के लिए रैपिड संक्रमण भी संदूषण के संकेत हो तो प्रकाश खुर्दबीन के नीचे संक्रमण के दृश्य संकेत के लिए पकवान का निरीक्षण कर सकते हैं.
प्रयोग और शर्तों बाँझ तकनीक पर निर्भर करता है, संस्कृतियों है कि ध्यान के लिए परवाह किया गया है एक साल से भी अधिक के लिए ^{जीवित} रहने के एक कर सकते हैं.

Meas से ई. रिकॉर्डिंग

प्रत्येक विदेश मंत्रालय 59 रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और एक आंतरिक जमीन इलेक्ट्रोड है. वहाँ कई वाणिज्यिक रिकॉर्डिंग उपलब्ध सिस्टम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बनाया कस्टम संस्करणों रहे हैं. विक्रेताओं मल्टी चैनल सिस्टम, टकर डेविस टेक्नोलॉजीज, Axion Biosystems, अल्फा मेड वैज्ञानिक MED64, Plexon, Ayanda Biosystems और जीवविज्ञान शामिल हैं. हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में मल्टी चैनल सिस्टम से एक व्यावसायिक स्थापना, एक Windows आधारित प्रणाली बुलाया ^NeuroRighter 15 कस्टम डिजाइन, और एक कस्टम डिजाइन लिनक्स ^{आधारित} 16 MeaBench नामक प्रणाली का उपयोग करता है . इन प्रणालियों के प्रत्येक meas (मल्टी चैनल सिस्टम) एक मल्टी चैनल सिस्टम preamplifier का उपयोग से रिकॉर्ड करने में सक्षम है. टकर डेविस टेक्नोलॉजीज से एक वाणिज्यिक सेटअप उपयोग में भी है. इस प्रोटोकॉल NeuroRighter साथ meas से रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करेंगे. फंटuroRighter खुले स्रोत सॉफ्टवेयर और NeuroRighter गूगल समूहों पर हार्डवेयर डिजाइन के साथ साथ मुफ्त डाउनलोड के लिए उपलब्ध है. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
Meas पर संस्कृतियों 2-3 सप्ताह लेने के लिए गतिविधि का एक स्थिर राज्य तक ^{पहुँचने} 17,18 इस गतिविधि सहज कार्रवाई क्षमता और संस्कृति के व्यापक शामिल फोड़ (कार्रवाई क्षमता के एक बांध है कि एक संस्कृति के पार synaptically फैलता). प्रयोग की प्रकृति लेकिन रिकॉर्डिंग से पहले इन विट्रो में दिनों की आदर्श संख्या का निर्धारण करेगा.
Neuronal गतिविधि आदर्श तापमान और पीएच सहित पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करता है एक परिणाम के रूप में ^1, हमारी रिकॉर्डिंग मशीन में जगह लेता है जैसा कि उपरोक्त वर्णित है . यदि कम प्रयोगों (<30 मिनट) डिजाइन कर रहे हैं, वहाँ भी एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीटिंग मॉड्यूल है कि आदर्श विदेश मंत्रालय के तापमान को बनाए रखने के लिए एमसीएस preamplifier से जोड़ा जा सकता है.
रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, विदेश मंत्रालय (अभी भी अपनी पेट्री डिश में) धीरे भंडारण इनक्यूबेटर से रिकॉर्डिंग इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया है. पकवान समानांतर के नीचे भूमि पर रखें. विदेश मंत्रालय या विवाद विदेश मंत्रालय के साथ जल्दी आंदोलनों से बचें के रूप में इन सब्सट्रेट से संस्कृति को अलग कर सकते हैं. विदेश मंत्रालय तो पेट्री डिश से हटा दिया है और रिकॉर्डिंग preamplifier में रखा. मैच बर्तन में आंतरिक जमीन इलेक्ट्रोड हम वर्तमान में preamplifier (एमसीएस preamplifier के लिए CR15 चैनल) जमीन पर इलेक्ट्रोड के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. एक ऊतक या कपास झाड़ू 70% इथेनॉल के साथ सिक्त उँगलियों के निशान या अन्य मलबे कि एक अच्छे संबंध में बाधा सकता है हटाने का उपयोग विदेश मंत्रालय की परिधि के आसपास संपर्कों को साफ कर लें. सुनिश्चित करना है कि विदेश मंत्रालय सही ढंग से बैठा है के बाद, preamplifier ढक्कन तो और कम जगह में latched. preamplifier ढक्कन पर संपर्कों मजबूती विदेश मंत्रालय पर इलेक्ट्रोड संपर्क पैड पर आराम करना चाहिए. दिखने में संपर्क संरेखण निरीक्षण और यदि आवश्यक हो तो एक कपास झाड़ू के साथ समायोजित. इनक्यूबेटर में Peltier डिवाइस पर preamp रखें. यह एक Peltier thermoelectric गर्मी उन दोनों के बीच sandwiched पंप के साथ दो तांबे प्लेटों के होते हैं. हम यह 5V के बारे में चलाने के लिए, preamp circuitry द्वारा उत्पादित गर्मी से कुछ दूर. यह Teflon झिल्ली ढक्कन के अंदर पर बनाने से संक्षेपण रोकता है. कोई संक्षेपण कोशिकाओं के साथ संपर्क में मध्यम, वाष्पीकरण के कारण osmolarity में वृद्धि से संस्कृति नुकसान का संकेत होगा. कि preamp और मध्यम इनक्यूबेटर हवा के तापमान के नीचे एक या दो डिग्री कर रहे हैं सुनिश्चित करने से, osmolarity में परिवर्तन कम से कम कर रहे हैं.
सत्ता NeuroRighter के लिए आपूर्ति पर मुड़ें और वर्कस्टेशन पर सॉफ्टवेयर खुला है. में इन विट्रो के लिए भी जगह में उचित सॉफ्टवेयर / हार्डवेयर के विन्यास के साथ NeuroRighter सेटिंग्स समायोजित करें. सॉफ्टवेयर में इलेक्ट्रोड की संख्या का चयन करें. आदेश में पृष्ठभूमि शोर की राशि को कम करने के लिए, एक डिजिटल फिल्टर बैंड पास सक्षम किया जा सकता है. अगर डेटा बाद में विश्लेषण के लिए सहेजा जा रहा है पर रिकॉर्ड स्विच के साथ एक डेटा फ़ाइल का चयन करें. प्रारंभ बटन सक्रिय एक बार सभी उचित सेटिंग्स को चुना जाता है.
स्क्रीन गतिविधि और पृष्ठभूमि शोर के निशान से चल रहे शो चाहिए. समसामयिक कार्रवाई क्षमता और गतिविधि के पकवान व्यापक फटने दिखाई जानी चाहिए. meas से निवारण रिकॉर्डिंग पर अनुभाग के नीचे कई आम मुद्दों पर चर्चा अगर उम्मीद गतिविधि कल्पना नहीं है.
स्क्रीन दृश्य स्पाइक पता लगाने के मोड ('SPK Wfms' टैब) जहां कार्रवाई क्षमता statically के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं वे 3ms समय खिड़कियों में होते बदला जा सकता है. दिए गए चैनल के लिए, असली कोशिकी कार्रवाई क्षमता लगभग 1ms पिछले है और एक ही दिशा (सकारात्मक या नकारात्मक) में बार - बार आग चाहिए चाहिए. कभी कभी, दो या दो से अधिक न्यूरॉन्स अलग छोर के साथ ही इलेक्ट्रोड पर दिखाई जा सकता है. एक कम समय के पाठ्यक्रम और चर polarity के साथ Spikes की संभावना artifact के हैं. चित्रा 1 स्पाइक के डेटा का एक रेखापुंज साजिश से पता चलता है.
स्क्रीन दृश्य गतिविधि फोड़ की मूल localizing पर एक नज़र के लिए स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFPs) को बदला जा सकता है. सेटिंग के इस प्रकार और अधिक उपयोगी हो सकता है जब vivo में रिकॉर्डिंग के बाद से monolayer संस्कृतियों कमजोर LFPs है सकते हैं. ध्यान से, कुछ preamplifiers (हम एक मल्टी चैनल सिस्टम से उपयोग सहित) 10 हर्ट्ज पर उच्च पास फिल्टर है जो कम आवृत्ति LFP लय attenuate जाएगा.

एफ meas पर उत्तेजक neuronal नेटवर्क

59 विदेश मंत्रालय पर एक ही रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भी संस्कृति उत्तेजक के लिए उपयोग किया जा सकता है. उत्तेजना की हद तक प्रयोग की प्रकृति का निर्धारण करेगा. NeuroRighter उत्तेजना प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए लचीलापन प्रदान करता है क्योंकि यह खुला स्रोत कोड ^है 15 .
एक संस्कृति उत्तेजक के साथ चुनौती यह है कि उत्तेजना एक artifact है कि कई मिसे पिछले कर सकते हैं बनाता है. इस artifact के काफी बड़े के लिए स्पाइक का पता लगाने और अस्पष्ट उत्तेजना प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर किया जा सकता है. NeuroRighteआर कम से कम और कुछ मामलों में अनिवार्य रूप से नष्ट करने उत्तेजना artifact के लिए SALPA ^{एल्गोरिथ्म} का इस्तेमाल 19.
विदेश मंत्रालय पर neuronal नेटवर्क को प्रोत्साहित करने के लिए, 'रिकॉर्डिंग सेटिंग्स' टैब के अंतर्गत SALPA एल्गोरिथ्म को प्रशिक्षित उत्तेजना artifact के सीमा. 'ऑनलाइन सेटिंग्स' टैब में सक्रिय SALPA. एक फ़ाइल नाम चुनें और पहले के रूप में रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए प्रारंभ बटन क्लिक करें. फिर 'Stim' टैब पर क्लिक करें. इस पृष्ठ पर उत्तेजना की स्थापना के लिए कई विकल्प हैं.
एक साधारण प्रयोग के लिए एक इलेक्ट्रोड को प्रोत्साहित और पकवान की जवाबदेही 'ओपन पाश' अनुभाग का उपयोग कर घड़ी है. दर, वोल्टेज, चरण चौड़ाई और चैनल संख्या का चयन करें. खुला लूप खंड में प्रारंभ बटन दबाएँ. इस उत्तेजना को प्रतिक्रियाएँ मुख्य Spikes '' टैब और 'SPK Wfms' टैब पर देखे जा और डेटा फ़ाइलों में विश्लेषण कर सकते हैं.
वास्तविक समय में, फटने समय बंद एकाधिक इलेक्ट्रोड के पार 0.5V के एक हर्ट्ज की उत्तेजना के तरीके में visualized किया जा सकता है. चित्रा 2 एक प्रतिक्रिया के बाद प्रोत्साहन के एक रेखापुंज साजिश से पता चलता है. पिछले टिप्पणियों का प्रदर्शन किया है कि वहाँ उत्तेजना - पैदा की गतिविधि के दो अलग अलग प्रकार के होते हैं: सीधे पैदा कार्रवाई (dAPs) क्षमता और synaptically पैदा कार्रवाई क्षमता (saps) ²⁰
संस्कृति में न्यूरॉन्स गतिविधि का सहज फटने है. कुछ प्रयोगों के लिए, फोड़ के इस प्रकार के नेटवर्क गतिशीलता को नियंत्रित करने के प्रयास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. दिलचस्प है, इलेक्ट्रोड प्रति 1-2 हर्ट्ज पर उत्तेजना वितरित विदेश मंत्रालय पर neuronal नेटवर्क में गतिविधि फोड़ दबाने शुरू ^कर 21 कर सकते हैं .

जी meas से मुसीबत शूटिंग रिकॉर्डिंग

कोई कार्रवाई नहीं की क्षमता या विदेश मंत्रालय जब सॉफ्टवेयर चालू है में जला वर्तमान:
1. काफी पुरानी संस्कृति है है? लड़ाई क्षमता इन विट्रो में पहले सप्ताह के अंत की ओर दिखाई जानी चाहिए. जला इन विट्रो में दो से तीन सप्ताह के आसपास होता है.
2. हार्डवेयर शक्ति प्राप्त है? NeuroRighter सिस्टम दो 6V नेतृत्व एसिड बैटरी का इस्तेमाल हार्डवेयर सत्ता में है. बिजली स्विच पर स्थिति और चार्ज बैटरी में की जरूरत है.
3. संस्कृति जीवित है? कई बार इस glial सेल अतिवृद्धि के कारण घने या पुराने संस्कृति में विशेष रूप से निर्धारित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. हालांकि, एक स्वस्थ दिखने (चमकदार चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत, अंडाकार आकार का सेल शरीर) न्यूरॉन्स और बरकरार (खंडित नहीं) सेल प्रक्रियाओं के लिए देख सकते हैं. वहाँ भी संस्कृति के साथ एक समस्या हो सकता है अगर वहाँ दिखाई संदूषण या तेजी से अपमानजनक मध्यम (मध्यम परिवर्तन के बीच केवल 1 2 दिनों के बाद अम्लीय बनने) के लिए सबूत है हो सकता है.
4. इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा क्या है? एकाधिक का उपयोग करता है से अधिक सूक्ष्म इलेक्ट्रोड या विदेश मंत्रालय के इन्सुलेशन नीचा कर सकते हैं. NeuroRighter इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा का आकलन करने की क्षमता है ^1kHz के आसपास 15 सामान्य प्रतिबाधा रीडिंग 10,000 और 100.000 Ohms के बीच सीमा चाहिए. उच्च impedances टूट जाता है या इलेक्ट्रोड और रीडिंग कम से कम 10,000 Ohms टपकाया इन्सुलेशन का सुझाव का सुझाव देते हैं.
5. Preamplifier हार्डवेयर बोर्ड से जुड़ा है? preamplifier एक निर्गम केबल है कि हार्डवेयर बोर्ड को जोड़ता है चाहिए. preamplifier भी 4 छोटे उत्तेजक औधधि बोर्डों भी है कि मुख्य हार्डवेयर बोर्ड से कनेक्ट करने और उत्तेजना के लिए ही महत्वपूर्ण हैं.
6. NeuroRighter सॉफ्टवेयर सेटिंग्स बदल दिया गया? सॉफ्टवेयर में हार्डवेयर विन्यास सेटिंग्स काम करने की रिकॉर्डिंग के लिए सही होना चाहिए. अधिष्ठापन अद्यतन संस्करण और एकाधिक उपयोगकर्ताओं को बदलने सेटिंग्स यह पैदा कर सकता है.
7. 35-37 में विदेश मंत्रालय है डिग्री सेल्सियस? कूलर तापमान cortical नेटवर्क में सहज गतिविधि में एक कमी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह आमतौर पर है क्योंकि रिकॉर्डिंग जलवायु नियंत्रित इनक्यूबेटर के भीतर होता है एक मुद्दा नहीं है, लेकिन तापमान संतुलन के लिए एक की अनुमति है अगर विदेश मंत्रालय इनक्यूबेटर बाहर कुछ ही सेकंड से अधिक के लिए किया गया है चाहिए.
8. मध्यम पिछले कुछ घंटों में बदल गया? हमने देखा है संस्कृतियों अक्सर खिलाने के बाद कई घंटे के लिए फायरिंग बंद. इसलिए, यह सबसे अच्छा है खिलाने से पहले प्रयोगों का संचालन करने के लिए.
अत्यधिक पृष्ठभूमि शोर saturating रिकॉर्डिंग खिड़की के साथ इलेक्ट्रोड:
1. विदेश मंत्रालय पर्याप्त पर इलेक्ट्रोड के साथ preamplifier पिन संपर्क है? यह समस्या preamplifier ढक्कन, कचरा का एक छोटा सा टुकड़ा, माध्यम की एक बूंद, अपमानित इलेक्ट्रोड सतह, या एक अतिव्यापी ढक्कन से स्पष्ट झिल्ली पर एक misaligned पिन के कारण हो सकता है. इन मुद्दों के लिए संपर्क का निरीक्षण पहला कदम है. एक कपास झाड़ू के साथ 70% इथेनॉल में भिगो पिन समायोजित कभी कभी संपर्क में सुधार, खासकर अगर वहाँ मध्यम है कि दूर सफाई की जरूरत है की एक बूंद थी. संकेत बदतर इथेनॉल evaporates तक प्रकट हो सकता है. </ Li>
2. इलेक्ट्रोड क्या क्षतिग्रस्त होना दिखाई देते हैं? प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विज़ुअलाइज़ेशन कभी कभी या टूट सकते हैं प्रकट इलेक्ट्रोड artifact के इस प्रकार के लिए अग्रणी इन्सुलेशन खड़ा है.
3. संपर्क पहने या खरोंच पैड हैं? कभी कभी वहाँ के विदेश मंत्रालय पर कई इलेक्ट्रोड संपर्क है कि अनुकूलन के लिए मुश्किल कर रहे हैं हो सकता है. यह कई का उपयोग करता है विदेश मंत्रालय और platings के बाद अधिक आम है. एक सोने के तार गर्भवती रबर स्पेसर अपनी 0.5mm मोटाई की दिशा में ही आयोजित करता है और विदेश मंत्रालय के साथ preamplifier पिन संपर्क में सुधार कर सकते हैं. इस सामग्री Fujipoly से उपलब्ध है और विदेश मंत्रालय और ढक्कन फिट प्यारा जा सकता है.
संपूर्ण विदेश मंत्रालय अत्यधिक पृष्ठभूमि शोर से पता चलता है:
1. सही ओरिएंटेशन में विदेश मंत्रालय के रूप में इतनी विदेश मंत्रालय पर जमीन इलेक्ट्रोड preamplifier जमीन पर पिन से संपर्क करने की अनुमति है? यदि विदेश मंत्रालय के सही ओरिएंटेशन में है, तो सुनिश्चित करना है वहाँ कोई जमीन संपर्क मुद्दों (2 एसी ऊपर) भी विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. चैनल CR15 preamp हवाई जहाज़ के पहिये के लिए एक छोटी तार के साथ आधारित है? छलांग लगाने का उपयोग करने के लिए यह आंतरिक 30 kOhm प्रतिरोधों के माध्यम से जमीन अतिरिक्त शोर में परिणाम सकता है.
2. वहाँ आसपास रोशनी, बिजली के सूत्रों या अन्य उपकरणों के टुकड़े से हस्तक्षेप है? हस्तक्षेप का सबसे आम रूपों में से एक रोशनी और उपकरणों से 60 हर्ट्ज है. रिकॉर्डिंग प्रणाली ठीक से आधारित होना चाहिए. बचाते उजागर केबल पृष्ठभूमि हस्तक्षेप को कम करने में भी सहायक हो सकता है है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 यह एक neuronal नेटवर्क से सहज गतिविधि के 2 मिनट के एक रेखापुंज साजिश है. प्रत्येक काले डॉट एक संभावित कार्रवाई का प्रतिनिधित्व करता है. नीले तीर के साथ गतिविधि के दो फटने संकेत कर रहे हैं. एकाधिक इलेक्ट्रोड पर प्रतिक्रिया नेटवर्क कनेक्टिविटी के एक समारोह है.

चित्रा 2. उत्तेजना - पैदा की गतिविधि के 16 सेकंड के एक रेखापुंज साजिश है. लाल सितारों उत्तेजनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. लाल तीर पांच उत्तेजनाओं कि सफलतापूर्वक कई इलेक्ट्रोड भर synaptic गतिविधि के फटने प्रेरित बताते हैं. कभी कभी, एक उत्तेजना एक फट उपज नहीं करता है नीले तीर पर यहाँ.

Discussion

इस प्रोटोकॉल संस्कृति को कैसे पर निर्देश से पता चलता है और बनाए रखने के सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों पर neuronal नेटवर्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग और neuronal नेटवर्क उत्तेजक एक परिचय. कुछ अधिक आम समस्याओं जब meas से रिकॉर्डिंग के विदेश मंत्रालय के समस्या निवारण अनुभाग में भी विचार - विमर्श किया गया. प्रोटोकॉल में कभी कभी बदलाव के रूप में भर में चर्चा की और बार बार इन परिवर्तनों के विशिष्ट निश्चित प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा आवश्यक शर्तों का अनुकूलन का उपयोग कर रहे हैं.

हालांकि रिकॉर्डिंग और उत्तेजक प्रणाली यहाँ प्रस्तुत हमारे NeuroRighter ¹⁵ एमसीएस preamp के साथ कस्टम डिजाइन के शामिल है, वहाँ कई अन्य प्रणालियों है कि neuronal नेटवर्क के साथ एक इंटरफेस प्रदान कर सकते हैं कर रहे हैं. एक विशेष सेटअप का चयन विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करेगा.

Simplistic रिकॉर्डिंग और उत्तेजना उदाहरण इस प्रोटोकॉल में प्रदान किया गया लेकिन meas पर इन संस्कृतियों synaptic गतिविधि और neuronal नेटवर्क कनेक्टिविटी के बारे में जटिल सवालों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, चल रहे काम इस प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए सेलुलर plasticity की तरह प्रक्रियाओं का अध्ययन कर रहा है, विकास, और ^{neurodegeneration} excitotoxicity उदाहरण के लिए 6-10, हमारी प्रयोगशाला से हाल ही में एक प्रकाशन से पता चला है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्ष्य इन विट्रो में वास्तविक समय बंद लूप उत्तेजना के साथ में सीखने का निर्देशन वर्तमान neuronal नेटवर्क गतिविधि ³ जवाब.

हालांकि विदेश मंत्रालय संस्कृतियों अक्सर नकचढ़ा और नाजुक, उनकी सादगी और पहुँच (बरकरार पशुओं की तुलना में) के लिए धन्यवाद, वे एक नेटवर्क के स्तर पर neuronal गतिविधि के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करते हैं.

Disclosures

CMH खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल पर अमूल्य टिप्पणियाँ उपलब्ध कराने के लिए पॉटर समूह के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम एक नैदानिक अनुसंधान न्यूरोलॉजी फाउंडेशन के अमेरिकन अकादमी से प्रशिक्षण CMH फैलोशिप, जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (NIGMS से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था http://www.nigms.nih.gov/ JDR (GM08169) ) से एक अनुदान NIH राष्ट्रीय संस्थान के मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NS054809), रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा JDR पुरस्कार (NS060392), एक NSF EFRI अनुदान (0,836,017), कल्टर फाउंडेशन translational अनुसंधान पुरस्कार, और एक JDR के लिए translational अनुसंधान फेलोशिप (NS007480).

Materials

Supplies

Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020)
Embryonic day 18 timed-pregnant female rat
Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1)
Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3)
Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340)
Polypropylene conical vials (sterile, 15ml)
Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm)
Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl)
Serological pipets (5ml)

Equipment:

Biological safety cabinet/laminar flow hood
Cell counter
Centrifuge
Container of ice
Dissecting scissors and forceps (sterilized)
Dissecting microscope in a laminar flow hood
Handheld electric pipetman
Hemacytometer
Isofluorane and gas chamber
Light microscope
Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl))
MEA recording system (see description in protocol, D1)
Rodent Guillotine
Tri-gas incubator (see description in protocol, B15)
Vacuum flask with aspirator attached in the hood
Vortex
Water bath (35-37°C)

Solutions and Reagents:

BSA solution:

Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months.

Cell Medium:

Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use.

Dissection solution for preparing papain solution:²³

Dissection solution (100ml stock)	Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C.
Component	Volume ml	Final Concentration (mM)
Double-distilled water	91.175
1 M MgCl₂	0.58	5.8 mM
1 M CaCl₂	0.025	0.25 mM
0.5 M HEPES	0.32	1.6 mM
0.5% Phenol red	0.2	(0.001%)
0.1 N NaOH	0.2	0.2 mM
2 M Na2SO4	4.5	90 mM
1 M K2SO4	3.0	30 mM
0.1 M Kynurenic acid	1.0	1 mM
5 mM APV	1.0	0.05 mM

This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months.

DNAse I:

Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process.

Hank’s balanced salt solution:

Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C.

Hibernate solution:

Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm.

Laminin solution:

Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin.

Papain solution:²³

Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol.

Polyethyleneimine (PEI) solution:¹³

100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months.

Sterile de-ionized water:

Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use.

Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200):

1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.

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