Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

Summary

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.

Abstract

Para o século passado, muitos neurocientistas de todo o mundo têm dedicado suas vidas para entender como as redes neuronais funcionam e por que parar de trabalhar em várias doenças. Estudos incluíram observação neuropatológicos, microscopia fluorescente com rotulagem genética, e gravação intracelular em ambos os neurônios dissociados e preparações fatia. Este protocolo discute outra tecnologia, que envolve o crescimento neuronal em culturas dissociadas micro-eletrodo arrays (também chamado de multi-eletrodo arrays, AAM).

Há múltiplas vantagens de usar este sistema através de outras tecnologias. Dissociada culturas neuronal em MEAs fornecer um modelo simplificado em que a atividade de rede podem ser manipulados com sequências de estimulação elétrica através de eletrodos múltiplos da matriz. Porque a rede é pequena, o impacto da estimulação é limitada a áreas observáveis, o que não é o caso de preparações intactas. As células crescem em uma monocamada fazer alterações na morfologia fácil de monitorar, com várias técnicas de imagem. Finalmente, as culturas em MEAs pode sobreviver por mais de um ano in vitro que remove todas as limitações inerentes de tempo claro com as técnicas de cultivo outras ^1.

Nosso laboratório e outros em todo o mundo estão utilizando esta tecnologia para fazer perguntas importantes sobre redes neuronais. O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas em MEAs. Em redes vitro fornecer um meio para pedir fisiologicamente questões relevantes na rede e níveis celulares levando a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção.

Protocol

A. Introdução

Há bilhões de neurônios no cérebro humano. Cada um desses neurônios pode ter centenas de milhares de conexões muitas vezes, com muitas células diferentes. Essas conexões porto os sinais que nos permitem caminhar, tocar piano, andar de bicicleta, rir, chorar, e lembre-se. Para o século passado, muitos neurocientistas de todo o mundo têm dedicado suas vidas para entender como as redes neuronais funcionam e por que parar de trabalhar em várias doenças.

Existem muitas ferramentas um pode usar quando assumir esta tarefa aparentemente insuperável. Estudos iniciais concentraram-se na observação de como neuropatológicos circuitos neurais são organizadas no cérebro de humanos e outros animais. O advento da microscopia de fluorescência e rotulagem genética alargou o âmbito destes estudos estruturais explorar composição celular até o nível de proteína e DNA.

Mas essas experiências não abordou a função dinâmica do cérebro, apenas a disposição estática. Para a compreensão da atividade neural em curso, as técnicas populares em geral, foco em análise de atividade eletrofisiológica com gravação intracelular. Neurônios isolados de culturas dissociadas fornecer um modelo reducionista útil, no entanto esta técnica é limitada por intervalos de tempo curto para gravar a partir de células individuais. Este modelo também fornece informações limitadas sobre as outras células na rede. Fatias de cérebro de roedores fornecer mais de um modelo realista onde a arquitetura cortical é mantida. Mas como fatias, mesmo quando cultivadas, têm uma vida útil limitada e pode ser tecnicamente desafiadora para manter viva, mantendo citoarquitetura ^2.

Outra tecnologia envolve o crescimento neuronal em culturas dissociadas micro-eletrodo arrays (também chamado de eletrodo de multi-arrays, AAM). Neurônios são banhados em MEAs que microeletrodos embutido no fundo do prato. Ao longo de três semanas, essas culturas formar redes de neurônios completo com axônios, dendritos e centenas, senão milhares de conexões sinápticas. Há múltiplas vantagens de usar este sistema através de outras tecnologias. Dissociada culturas neuronal em MEAs fornecer um modelo simplificado com o qual trabalhar (na ordem de uma única coluna cortical ao invés de um cérebro intacto). As células crescem em uma monocamada fazer alterações na morfologia fácil de monitorar, com várias técnicas de imagem. Atividade de rede podem ser manipulados com sequências de estimulação elétrica através de eletrodos múltiplos da matriz. Porque a rede é pequena, o impacto da estimulação é limitada a áreas observáveis, o que não é o caso de preparações intactas. Finalmente, as culturas em MEAs pode sobreviver por mais de um ano in vitro que remove todas as limitações inerentes de tempo claro com as técnicas de cultivo outras. ¹ Portanto, as culturas em MEAs representam um modelo ideal para estudar a conectividade neuronal.

Nosso laboratório e outros em todo o mundo estão utilizando esta tecnologia para fazer perguntas importantes sobre redes neuronais. Atuais processos neuronais em estudo com este modelo inclui dinâmica de rede, desenvolvimento, aprendizagem e memória, plasticidade sináptica, excitotoxicidade, isquemia e neurodegeneração. ^3-10 Os resultados destes estudos poderiam ter implicações significativas para o estabelecimento de melhores tratamentos para doenças humanas, como as malformações congênitas, epilepsia , acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer. O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a criação, cuidando, gravação de culturas e estimulante sobre MEAs. O objetivo final é fornecer um meio para os pesquisadores de fazer perguntas fisiologicamente relevantes a nível celular e de rede que talvez possa levar a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção e, finalmente, o tratamento de doenças que afetam nossos neurônios e como eles se comunicam.

O protocolo a seguir representa mais de 10 anos de experiência de nosso laboratório em cultura, a gravação de redes neuronais e estimulante sobre eletrodo de micro-arrays. Cada passo foi optimizado de forma a levar ao desenvolvimento de longo sobreviventes saudáveis ​​redes neuronais. Referências são fornecidas quando disponível, enquanto alguns ajustes ideais que determinada empiricamente. Antes de iniciar o protocolo, obtenção de equipamentos e suprimentos e preparar soluções, conforme listado na seção intitulada "Materiais". A seção sobre 'Dissection Cérebro' será discutido brevemente, mas não demonstrado no vídeo que acompanha o Jornal de outros artigos Experiment visualizada cobrir esse tópico ^11.

B. Dissecção Cérebro

1. Cérebros inteiros são extraídos de ratos embrionários dia 18 (E18). Cronometrado grávidas ratas são anestesiados com isoflurano inalado e decapitado. Embriões são removidos e dissecados de acordo com Guid o Conselho Nacional de Pesquisae para o cuidado e uso de animais de laboratório, utilizando um protocolo aprovado pela Universidade Emory IACUC.
2. Enquanto utiliza uma técnica asséptica, os cérebros embrionárias são removidos e colocados em solução de Hank frio Sais balanceada (HBSS) em 100 milímetros prato de Petri estéreis. O restante do protocolo de dissecção ocorre sob um microscópio de dissecação em uma capela de fluxo laminar para minimizar o risco de contaminação.
3. Os cérebros de ratos são transferidos um de cada vez para uma placa de Petri segunda estéril com HBSS para dissecção. Enquanto submerso em HBSS, o tronco cerebral, tálamo e cerebelo são cortados e os hemisférios são dividido.
4. O tubérculo olfativo é utilizado como uma alça para garantir o hemisfério, enquanto delicadamente removendo as meninges.
5. O córtex é, então, descoladas do hipocampo e estriado subjacente e armazenadas em um tubo estéril 15 ml cônico no hibernate solução no gelo. ¹² Uma vez que existem embriões geralmente múltiplos, este procedimento é, então, repetida de acordo com o número desejado de MEAs para ser banhado ea densidade de célula desejada. Córtices são combinados para o processo de dissociação de células, como discutido abaixo. Córtices podem ser armazenadas a 4 ° C em solução de hibernação por até 24 horas antes da dissociação com apenas uma perda mínima de viabilidade celular. Como uma alternativa à utilização de tecidos dissecados in-house, tecido cerebral pode ser dissecado compra de Bits Brain ( www.brainbitsllc.com ).

C. preparação MEA e dissociação cortical

1. Os MEAs são obtidos a partir ALA Científica ( www.alascience.com ), um fornecedor para o fabricante, Multi-Channel Systems. Existem várias configurações diferentes para o MEAs com variações na orientação e espaçamento de eletrodos, a presença ou ausência de um campo de presença eletrodo interno, ou a ausência de um anel de vidro, eo tamanho do anel de vidro. Para os nossos experimentos básicos que usamos a matriz micro-eletrodo padrão contendo 60 eletrodos em um arranjo de 8 por 8 grade com um anel de vidro. O diâmetro do eletrodo de titânio nitreto é 30 mm ea distância entre os centros de eletrodo é 200 mM. Um dos eletrodos é maior e funciona como o solo ou eletrodo de referência interna. Ao manusear MEAs, é vitalmente importante que nenhum objeto sólido (por exemplo, pontas de pipeta, lenços de papel, ou policiais de borracha) nunca toque o interior do prato, pois isso pode danificar os eletrodos. Informações mais detalhadas sobre MEAs e manuseio podem ser encontrados no usuário MEA manual ( www.multichannelsystems.com / products-mea / microeletrodo arrays.html- ).
2. Na noite antes da preparação da célula, a MEAs são lavados com água desionizada e, em seguida de molho em etanol 70% por 15 minutos. Os pratos são, então, colocado em uma capela de fluxo laminar, com a luz UV ligado durante a noite. Para fins de tratamento, cada MEA é colocado em um prato de 100 mm padrão Petri estéreis de poliestireno com datas e rotulagem colocado na placa de Petri. De nota, técnicas de esterilização, incluindo autoclavagem e utilizando água a 90 ° C são mencionados no manual de usuários MEA. No entanto, temos encontrado empiricamente que autoclavagem parece diminuir o número de vezes que um MEA pode ser usado. Se você estiver reutilizando MEAs que atualmente têm culturas, então a matéria orgânica deve ser removido. 300-400 mL de tripsina 0,25% em PBS é incubada na MEA a 35-37 ° C por 20 minutos. A MEA é lavado com água desionizada e então inspecionado com um microscópio de luz. Se a matéria celular ainda permanece, então, o passo a tripsina é repetido até que limpo. Se o prato está limpo, então prosseguir com a fase de esterilização como acima. Em geral, os acordos ambientais multilaterais podem ser reutilizados várias vezes com os cuidados adequados.
3. Também na noite anterior ao revestimento, as tampas MEA são preparados e autoclavados. As tampas são feitos, mas também pode ser comprado de ALA-Científica. Eles são feitos de Teflon politetrafluoroetileno e ter uma membrana transparente (etileno-propileno fluorado Teflon) esticada na parte superior. A membrana permite a difusão de gases, mas limita a difusão da água, assim, praticamente eliminando a necessidade de uma atmosfera húmida e prevenir os efeitos deletérios da evaporação e hiperosmolaridade ^1.
4. Uma vez que a dissecção acima é completa, preparação MEA continua colocando 100 ml de solução Polietilenoimina (PEI) para o centro de cada MEA. ¹³ Em nossas mãos, a solução fornece menos PEI agrupamento de células do MEA que usar polilisina. O prato é permitido sentar-se à temperatura ambiente na câmara de fluxo laminar por 30 minutos com as pálpebras levemente apoiado no MEAs para evitar a evaporação. Como um lembrete, qualquer trabalho com o MEA aberto ou tecido cerebral deve ocorrer em uma célula capô cultura padrão de fluxo laminar para miniminimizar o risco de contaminação.
5. A MEA é então lavado 3 vezes com ml 1-2 de água deionizada estéril. O ideal câmara de fluxo laminar de configuração incluirá um aparelho aspirador para remover líquido de pratos. A ponta da pipeta estéril 200μl pode ser conectado à tubulação de aspiração. Não toque na superfície da MEA, enquanto aspiração, pois isso pode danificar os eletrodos. Após o enxágüe final, a MEA é permitida para secar por pelo menos 30 minutos na capela de fluxo laminar.
6. Durante este período de secagem, o processo de dissociação neuronal é iniciado colocando o córtex em 2 ml de solução de papaína em um frasco plástico de 15 ml cônico estéril. ^{1 ml} 50 de DNAse é adicionado à mistura. O frasco é colocado em banho-maria a 35-37 ° C e incubados por aproximadamente 20 minutos. Bata suavemente a solução a cada 5 minutos para misturar com cuidado para evitar a introdução de bolhas. O córtex deve começar a assumir uma aparência difusa como o produto da digestão.
7. A solução papaína é então cuidadosamente removidas por pipetagem deixando o córtex no frasco 15ml cônico. 2 ml de meio de células é adicionado ao córtex, permitido incubar por 2-3 minutos e então delicadamente removidos. Este é para eliminar qualquer papaína residual, que também será inibida pelo soro no meio. Outra 2ml de meio de células é adicionado ao córtex e esta amostra é então centrifugadas em alta velocidade por 5-10 segundos. Deve haver uma solução turva no fundo do frasco de 15ml cônicos e não pedaços do cérebro restantes. Alternativamente, trituração com 1 ml de meio por 3 vezes usando um hand-held P-1000 pipeta pode ser utilizada para dissociar o tecido. Para ^uma adequada trituração, cada curso pipeta deve ter um segundo.
8. A solução é, então, permissão para passar suavemente através de um filtro de células estéreis 40μm através da gravidade. Lentamente, adicionar a solução da célula de uma gota em um momento no coador com um P-1000. A 35 milímetros placa de Petri esterilizada é utilizada para coletar a solução de células tensas.
9. A suspensão de células é então transferido de volta para um frasco de 15 ml cônico e média célula é adicionada a um volume final de 4,0 ml. ¹⁴
10. 500 mL de uma solução de BSA 5% w / v é então cuidadosamente em camadas no fundo do frasco de 15ml cônica com um P-1000. ¹⁴ Isto irá deslocar para cima de células contendo solução no frasco.
11. A solução da pilha com BSA em camadas no fundo é então centrifugado por 6 minutos a 200 xg para remover detritos pequenas e potencialmente tóxicos conteúdo intracelular ^14.
12. Durante a etapa de centrifugação de células, o MEAs são avaliados visualmente para garantir que eles estejam completamente secas. 20 ml de solução laminina são, então, cuidadosamente colocado no centro da MEA assegurar que todos os eletrodos são cobertos. ¹ Evite a introdução de bolhas de ar para esta solução desde que podem levar a preparação inadequada da superfície do eletrodo. Se o MEA não é completamente seca, em seguida, a gota de laminina vai se espalhar por todo o prato o que poderia tornar mais difícil localizar adequadamente as células ao longo dos eletrodos quando chapeamento. Esta etapa é muito delicada e tem o potencial de levar a MEA danos na superfície com uma mão trêmula ou lapso de atenção.
13. As tampas de Teflon são colocados no MEA neste momento para evitar a evaporação da laminina. Colocação da tampa também é delicada. A tampa só deve ser colocado ou removido quando a MEA é sobre uma superfície completamente plana. Caso contrário, as forças extras exercida por uma superfície irregular pode rachar o fundo de vidro do array tornando-o inutilizável. O prato é então colocado na incubadora por 20 minutos.
14. Enquanto a laminina é vinculativa para o prato, os 15 ml frasco cónico contendo as células é retirado da centrífuga e transferido de volta para a capela de fluxo laminar. A pelota deve estar visível no fundo do frasco. O sobrenadante é cuidadosamente removida com uma pipeta de plástico estéril 5ml sorológicos. Salve o sobrenadante no caso de o processo de centrifugação foi incompleta. O pellet é ressuspenso em seguida, gentilmente, quer por trituração com um P-1000 ou um vórtice rápido em 300-500 mL de meio de células, dependendo do rendimento esperado. 10 ml de suspensão de células é removido e colocado em um hemocitômetro para determinar a concentração de células. Se o rendimento é baixo, analisar o sobrenadante sob o microscópio para determinar se a etapa de centrifugação foi incompleta. Centrifugação repetir pode ser necessária. Se o rendimento é alto, então uma diluição pode ser necessário para mais uma contagem precisa. Densidade de células de revestimento pode variar de 5.000 a 300.000 células por MEA. Calcular uma diluição de modo que o número desejado de células para revestimento é em um volume final de 15-20 mL. Normalmente usamos uma concentração final de 1000 a 3000 células por microlitro. Um par de córtices normalmente rendimento entre 10 e 15 milhões de células. Este número pode ser ligeiramente menor se a trituração é utilizado.
15. Por este tempo, tele laminina incubação no MEA devem ser completas. A tampa de teflon é removido do MEA e grande parte da queda laminina vácuo aspirados ou pipetado distância. Então mL 15-20 da suspensão de células desejado é imediatamente pipetado para a área residual molhada de laminina. Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar no seu pequeno volume de suspensão de células como as bolhas de ar pode impedir as células de forma uniforme cobrindo todos os eletrodos. A tampa é substituída suavemente eo MEA é cuidadosamente colocado de volta na incubadora por 30 minutos. O prato é então inspecionada sob o microscópio de luz para assegurar que as células aderiram e cobrir todos os eletrodos. Se todos os eletrodos não são cobertas, em seguida, mais células podem ser adicionados e as MEA é colocada de volta na incubadora com tampa para permitir que essas novas células para aderir. Se um tubo de suspensão de células é usado mais do que alguns minutos depois de se sentar sem perturbações, certifique-se suavemente agite-a para voltar a suspender as células resolvido. Uma vez que a cobertura do eletrodo adequado é alcançado, então o prato é lentamente inundada com 1 ml de água morna (35-37 ° C) média das células. A tampa de teflon é substituído eo prato é colocado de volta na incubadora. A capela de fluxo laminar podem rapidamente secar os volumes laminina pequenas e volumes suspensão celular uma vez no MEA por isso tome cuidado para mantê-los fechados com as tampas de teflon. O ambiente ideal para a incubadora MEAs selada é de 5% CO _2, 9% O ₂ e umidade de 65% a 35-37 ° C. Baixa tensão de oxigênio é importante para culturas a longo prazo, reduzindo o dano oxidativo. ¹² Manter 65% de umidade reduz a evaporação através da membrana de teflon (em comparação com nenhum controle de umidade) e permite MEA eletrônicos a serem utilizados na incubadora sem danos decorrentes da condensação da água (como com uma incubadora normais umidificado à saturação).

D. Mudando meio celular e cuidar de culturas dissociadas em MEAs

1. No dia após o plaqueamento das células, inspecionar o MEA sob o microscópio de luz. Se a cor do meio ainda é a de pêssego de cor vermelha e há uma quantidade limitada de restos celulares e morte celular, então a mudança primeiro meio pode ser adiada para outro dia. No entanto, se o meio está começando a aparecer mais laranja ou de cor amarela e / ou há uma grande quantidade de restos celulares e morte celular, em seguida, alterar o meio. Todas as alterações médio deve ocorrer em uma célula capô cultura padrão de fluxo laminar.
2. A mudança primeiro meio consiste em remover a tampa MEA, aspiração fora todos do meio no prato, substituindo a quantidade removida com média de células frescas, e então substituindo a tampa. Substituir o valor total da média de células sobre a mudança primeiro meio para remover quaisquer detritos remanescentes celulares do processo de galvanização. Subsequentes alterações a médio só deve aspirar afastado cerca de metade do meio seguidos pela substituição da quantidade removida com meio fresco. Isso permite que alguns dos fatores de crescimento que foram secretadas no meio celular para permanecer com as células a manutenção de um ambiente mais ideal de crescimento. Se a parte inferior da tampa é contaminada durante o processo de mudança de médio ou se a tampa mostra sinais de danos ou largas, em seguida, utilizar uma tampa nova autoclavado. Médio de células podem ser armazenadas na incubadora em um recipiente esterilizado com tampa personalizada modificados (que tem uma membrana de Teflon (etileno-propileno fluorado) para permitir a troca gasosa). Médio de células podem também ser armazenados a 4 ° C, mas quente e equilibrar esta na incubadora antes de médio mudando.
3. Remover e substituir cerca de metade da média em um prato de cerca de duas vezes por semana. Algumas preparações de células pode levar a mudanças de cores mais rápida no meio causando uma necessidade de mudanças mais freqüentes. Se o meio é anotado para ser amarelo, em seguida, altere o valor total do meio. Rápida transição para o amarelo também pode ser o sinal de contaminação para inspecionar o prato sob o microscópio de luz para os sinais visuais de infecção.
4. Dependendo das condições de experimentação e técnica estéril, culturas que foram cuidadosamente cuidadas podem sobreviver por mais de um ano ^1.

E. Gravação de MEAs

1. Cada MEA tem 59 eletrodos de registro e um eletrodo de aterramento interno. Existem vários sistemas de gravação de comerciais disponíveis, bem como versões personalizadas feitas. Fornecedores incluem Multi-Channel Systems, Tucker Davis Technologies, Axion Biosystems, Alpha Med Científica MED64, Plexon, Ayanda Biosystems e BioLogic. Nosso laboratório atualmente usa uma configuração comercial da Multi-Channel Systems, uma personalizados sistema Windows, chamada NeuroRighter ^15, e uma personalizados Linux sistema baseado chamados ¹⁶ MeaBench. Cada um desses sistemas é capaz de gravar a partir de MEAs (Multi-Channel Systems) usando um Multi-Channel pré-amplificador Systems. Uma configuração comercial da Tucker Davis Technologies também está em uso. Este protocolo irá demonstrar a gravação de MEAs com NeuroRighter. NeuroRighter software é open-source e está disponível para download gratuito, juntamente com os projetos de hardware em grupos NeuroRighter Google. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Culturas em MEAs tomar 2-3 semanas para chegar a um estado constante de actividade. ^17,18 Esta actividade inclui potenciais de ação espontânea e da cultura em toda a estourar (a barragem de potenciais de ação que se propaga através de um sinapticamente cultura). A natureza do experimento no entanto irá determinar o número ideal de dias in vitro antes da gravação.
3. Atividade neuronal é dependente de condições ambientais ideais incluindo a temperatura e pH. ¹ Como resultado, nossa gravação acontece na incubadora, como descrito acima. Se experiências de curta duração (<30 minutos) são projetados, há também um módulo de aquecimento comercialmente disponíveis que podem ser conectados ao pré-amplificador MCS para manter a temperatura ideal MEA.
4. Para iniciar a gravação, a MEA (ainda em sua placa de Petri) é gentilmente transferidos da incubadora de armazenamento para a gravação incubadora. Mantenha o fundo do prato paralela ao chão. Evite movimentos rápidos com a MEA ou abalo da MEA como estes podem retirar a cultura do substrato. A MEA é então removido da placa de Petri e colocados no pré-amplificador de gravação. Coincidir com o eletrodo de aterramento interno nos pratos atualmente estamos demonstrando com o eletrodo terra sobre o pré-amplificador (canal CR15 para o pré-amplificador MCS). Limpe os contatos em todo o perímetro da MEA usando um tecido ou cotonete embebido em álcool 70% para remover impressões digitais ou outros detritos que possam prejudicar uma boa conexão. Depois de garantir que o MEA está posicionado corretamente, a tampa do pré-amplificador é então abaixada e travada no lugar. Os contatos sobre a tampa do pré-amplificador deve descansar firmemente nas almofadas eletrodo de contato no MEA. Inspecionar visualmente o alinhamento e ajuste de contato com um cotonete, se necessário. Coloque o pré-amplificador para o dispositivo Peltier na incubadora. Este consiste em duas placas de cobre com uma bomba de calor Peltier termoelétrica ensanduichada entre elas. Nós rodamos este em cerca de 5V, para remover parte do calor produzido pelo circuito pré-amplificador. Isso evita que a formação de condensação no interior da tampa de membrana de teflon. Qualquer condensação poderia indicar danos a cultura por um aumento da osmolaridade do meio em contato com as células, devido à evaporação. Ao assegurar o pré-amplificador que eo meio são um ou dois graus abaixo da temperatura do ar da incubadora, as mudanças na osmolaridade são minimizados.
5. Ligue a fonte de alimentação NeuroRighter e abrir o software na estação de trabalho. Ajustar as configurações para NeuroRighter in vitro com configurações adequadas software / hardware também no lugar. Selecione o número de eletrodos no software. , A fim de reduzir a quantidade de ruído de fundo, um filtro digital passa-banda pode ser ativado. Selecione um arquivo de dados com a chave no registro se os dados estão a ser guardados para análise posterior. Ativar o botão de arranque uma vez que todas as configurações adequadas são escolhidos.
6. A tela deve mostrar executando os traços de atividade e ruído de fundo. Potenciais de ação e explosões ocasionais prato gama de atividade deve ser visível. A seção abaixo sobre a gravação de solução de problemas MEAs discutirá várias questões comuns se a atividade esperada não é visualizado.
7. A visualização da tela pode ser alterado para modo de detecção de pico (separador 'Spk WfMS') onde os potenciais de ação são exibidos estaticamente como eles ocorrem em janelas de tempo de 3 ms. Para um determinado canal, real potenciais de ação extracelulares deve durar aproximadamente 1ms e deverá ser acionado repetidamente na mesma direção (positivo ou negativo). Ocasionalmente, dois ou mais neurônios pode ser visível no mesmo eletrodo com diferentes polaridades. Spikes com um curso curto espaço de tempo e polaridade variável são artefato provável. A Figura 1 mostra um gráfico raster de dados espiga.
8. A visualização da tela pode ser alterado para potenciais de campo locais (LFPs) para um olhar para localizar a origem de explosão atividade. Este tipo de configuração pode ser mais útil para gravar in vivo desde culturas monocamada têm LFPs fraco. De nota, alguns pré-amplificadores (incluindo uma que usamos de Multi-Channel Systems) têm filtros passa-alta de 10 Hz que irá atenuar ritmos menor LFP freqüência.

F. Estimulando redes neuronais em MEAs

1. O mesmo 59 eletrodos de registro em um MEA também pode ser utilizado para estimular a cultura. A natureza do experimento será determinar o grau de estimulação. NeuroRighter oferece flexibilidade para o projeto experimental de estimulação, pois é o código-fonte aberto. ¹⁵
2. O desafio com estimulando uma cultura é que o estímulo cria um artefato que pode durar vários milissegundos. Este artefato pode ser grande o suficiente para provocar aumento de detecção e respostas estímulo obscura. NeuroRighter utiliza o algoritmo Salpa para minimizar e, em alguns casos, essencialmente, eliminando o artefato de estímulo. ¹⁹
3. Para estimular a rede neuronal no MEA, treinar o algoritmo Salpa na aba 'configurações de gravação "para limitar o artefato estimulação. Ativar Salpa no separador "Definições Online '. Selecione um nome de arquivo e clique no botão Iniciar como antes para iniciar a gravação. Em seguida, clique em 'Stim' tab. Existem muitas opções para a criação de estimulação nesta página.
4. Um experimento simples é estimular um eletrodo e ver a resposta do prato usando a seção "Loop aberto". Selecione a taxa de tensão, largura de fase, e número do canal. Pressione o botão Iniciar na seção de malha aberta. As respostas a esta estimulação pode ser visualizado na guia principal "Spikes" e na guia 'Spk WfMS e analisados ​​nos arquivos de dados.
5. Em tempo real, rajadas podem ser visualizados em uma maneira tempo-locked a um estímulo hertz um dos 0.5V através de eletrodos múltiplos. A Figura 2 mostra um gráfico raster de uma resposta pós-estímulo. Observações anteriores demonstraram que existem dois tipos diferentes de estímulo evocado actividade:. Potenciais de ação direta evocado (DAPs) e potenciais de ação sinapticamente evocados (PAE) ²⁰
6. Neurônios em cultura têm explosões espontâneas de atividade. Para alguns experimentos, este tipo de explosão pode interferir com a tentativa de controlar a dinâmica de rede. Curiosamente, distribuídos em 1-2 Hz de estimulação por eletrodo pode começar a estourar suprimir a atividade em uma rede neuronal em um MEA. ²¹

G. gravação Resolução de problemas de MEAs

1. Sem potenciais de ação ou presente estourando na MEA quando o software está ligado:
   1. É a velha cultura suficiente? Potenciais de ação devem ser visíveis no final da primeira semana in vitro. Estouro ocorre em torno de duas a três semanas in vitro.
   2. É o hardware recebendo energia? O sistema utiliza dois NeuroRighter 6V baterias chumbo-ácidas ao poder do hardware. O interruptor de alimentação precisa estar na posição ligado e as baterias carregadas.
   3. É a cultura viva? Às vezes isso pode ser um desafio para determinar especialmente na cultura densa ou mais por causa do crescimento exagerado de células gliais. No entanto, pode-se olhar para os neurônios saudáveis ​​aparecendo (brilhante, elíptica corpos celulares em forma sob microscopia de contraste de fase) e intacta (não fragmentado) processos celulares. Também pode haver um problema com a cultura se houver evidência de contaminação visível ou degradante rapidamente médio (tornando-se ácida depois de apenas 1 a 2 dias entre as mudanças médias empresas).
   4. Qual é a impedância do eletrodo? Mais de usos múltiplos, os eletrodos micro-ou o isolamento de um MEA podem degradar. NeuroRighter tem a capacidade de avaliar a impedância dos eléctrodos. Impedância de ¹⁵ leituras Normal em torno de 1kHz deve variar entre 10.000 e 100.000 Ohms. Impedâncias mais elevadas sugerem leva quebrado ou eletrodos e leituras menos de 10.000 Ohms sugerem isolamento gotejante.
   5. É o pré-amplificador conectado à placa de hardware? O pré-amplificador deve ter um cabo de saída que se conecta à placa de hardware. O pré-amplificador também tem 4 placas de estimulador de pequeno porte que também se conectam à placa de hardware principal e são importantes para a estimulação apenas.
   6. Ter as definições de NeuroRighter software foi alterado? Configurações de hardware de configuração no software deve ser correto para a gravação para o trabalho. Instalação de versões atualizadas e múltiplas configurações de usuários em mudança pode causar isso.
   7. É o MEA a 35-37 ° C? Temperaturas mais frias podem levar a uma redução da atividade espontânea em redes cortical. Isso geralmente não é um problema desde a gravação ocorre dentro da incubadora de clima controlado, no entanto deve-se permitir que uma situação de equilíbrio de temperatura se o MEA foi fora da incubadora por mais de alguns segundos.
   8. Tem a média foi alterado na últimas horas? Temos observado as culturas, muitas vezes parar de atirar por várias horas após a alimentação. Portanto, o melhor é conduzir experimentos antes da alimentação.
2. Eletrodo com a saturação excessiva de ruído de fundo da janela de gravação:
   1. É o contato do pino pré-amplificador com o eletrodo na MEA suficiente? Este problema pode ser causado por um pino desalinhados sobre a tampa do pré-amplificador, um pequeno pedaço de lixo, uma gota de médios, a superfície do eletrodo degradadas, ou uma membrana clara sobreposição da tampa. Inspecionando o contato para essas questões é o primeiro passo. Ajustar o pin com um cotonete embebido em álcool 70% às vezes pode melhorar o contato, especialmente se houve uma queda de meio de limpeza que precisavam de distância. O sinal pode parecer pior até que o evapora etanol. </ Li>
   2. Será que o eletrodo parecem ser danificado? Visualização ao microscópio de luz pode, por vezes, revelar rachado ou pitted de isolamento do eletrodo levando a esse tipo de artefato.
   3. São as pastilhas de contato usadas ou arranhado? Às vezes pode haver vários contatos de eletrodos na MEA que são difíceis de otimizar. Isso é mais comum após múltiplos usos MEA e chapeamentos. Um fio de ouro espaçador de borracha impregnada realiza apenas na direção de sua espessura 0,5 mm e pode melhorar o contato com o pré-amplificador pin MEA. Este material está disponível a partir Fujipoly e pode ser bonito para se ajustarem ao MEA e tampa.
3. MEA toda mostra de ruído de fundo:
   1. É o MEA com a orientação correta de modo a permitir o eletrodo terra sobre o MEA entrar em contato com o pino terra no pré-amplificador? Se o MEA está na orientação correta, então assegurando que não existem problemas de chão de contato (2 ac acima) é também importante a considerar. CR15 é o canal aterrado com um fio curto para o chassis preamp? Usando o jumper para a terra através interna resistores 30 kOhm pode resultar em excesso de ruído.
   2. Há interferência de luzes vizinhas, fontes de alimentação ou outros equipamentos? Uma das formas mais comuns de interferência é de 60 Hz de luzes e equipamentos. O sistema de gravação deve ser devidamente fundamentada. Blindagem os cabos expostos também pode ser útil para reduzir a interferência de fundo.

Resultados representante

Figura 1. Esta é uma trama de varredura de 2 minutos de atividade espontânea de uma rede neuronal. Cada ponto preto representa um potencial de ação. Duas explosões de actividade são indicados com as setas azuis. A resposta sobre eletrodos múltiplos é uma função da conectividade de rede.

Figura 2. Aqui é um gráfico raster de 16 segundos de estímulo evocado atividade. Estrelas vermelhas representam estímulos. As setas vermelhas mostram cinco estímulos que sucesso induzida rajadas de atividade sináptica através de eletrodos múltiplos. Ocasionalmente, um estímulo não produz uma explosão, aqui na seta azul.

Discussion

Este protocolo apresenta instruções sobre como a cultura e manter redes neuronais em micro-eletrodo de matrizes, bem como uma introdução para a gravação de redes neuronais e estimulante. Alguns dos problemas mais comuns durante a gravação de MEAs também foram discutidos na seção de solução MEA. Existem variações ocasionais no protocolo como discutido ao longo e muitas vezes essas mudanças são utilizados para otimizar as condições específicas exigidas por alguns projetos experimentais.

Embora o sistema de gravação e estimular aqui apresentada é composta por nossa personalizados NeuroRighter ¹⁵ com o pré-amplificador MCS, existem vários outros sistemas que podem fornecer uma interface com as redes neuronais. Escolher uma configuração particular dependerá das necessidades específicas experimental.

Gravação simplista e exemplos de estimulação foram fornecidas neste protocolo no entanto essas culturas em MEAs pode ser usado para fornecer informações sobre questões complexas sobre a atividade sináptica e conectividade de rede neuronal. Como mencionado acima, o trabalho em curso está utilizando esta tecnologia para estudar processos como plasticidade celular, excitotoxicidade, desenvolvimento e neurodegeneração. ^60-10 Por exemplo, uma publicação recente de nosso laboratório mostraram reprodutíveis objetivo dirigido aprendizagem in vitro com real-tempo de estimulação de malha fechada em resposta à atividade neuronal rede atual ^3.

Embora a cultura MEA são muitas vezes finicky e delicado, graças à sua simplicidade e acessibilidade (em comparação com animais intactos), eles oferecem um modelo poderoso para estudar a atividade neuronal em um nível de rede.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.