Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

Summary

Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales.

Abstract

Durante el último siglo, muchos neurocientíficos de todo el mundo han dedicado su vida a la comprensión de cómo las redes neuronales funcionan y por qué dejar de trabajar en diversas enfermedades. Los estudios han incluido observaciones neuropatológicas, microscopía de fluorescencia con el etiquetado de genética, y el registro intracelular, tanto en neuronas disociadas y preparaciones rebanada. Este protocolo describe otra tecnología, que consiste en cultivar cultivos de neuronas disociadas en matrices de micro-electrodos (también llamados electrodos múltiples arrays, AAM).

Hay muchas ventajas de usar este sistema frente a otras tecnologías. Disociarse cultivos neuronales en los acuerdos ambientales multilaterales proporcionan un modelo simplificado en el que se puede manipular con la actividad de red secuencias de estimulación eléctrica a través de múltiples electrodos de la matriz. Debido a que la red es pequeña, el impacto del estímulo se limita a las áreas observables, que no es el caso de las preparaciones intactas. Las células crecen en una monocapa de hacer cambios en la morfología fácil de controlar con técnicas de imagen. Finalmente, los cultivos en los acuerdos ambientales multilaterales pueden sobrevivir durante más de un año in vitro que elimina las limitaciones de tiempo claro inherentes a las técnicas de cultivo de otros ^1.

Nuestro laboratorio y otros en todo el mundo están utilizando esta tecnología para hacer preguntas importantes acerca de las redes neuronales. El objetivo de este protocolo es proporcionar la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales. En las redes in vitro proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.

Protocol

A. Introducción

Hay miles de millones de neuronas en el cerebro humano. Cada una de estas neuronas puede tener cientos de miles de conexiones a menudo con muchas células diferentes. Estas conexiones puerto de las señales que nos permiten caminar, tocar el piano, montar en bicicleta, reír, llorar y recordar. Durante el último siglo, muchos neurocientíficos de todo el mundo han dedicado su vida a la comprensión de cómo las redes neuronales funcionan y por qué dejar de trabajar en diversas enfermedades.

Hay muchas herramientas que se pueden utilizar cuando se toma en esta tarea aparentemente insuperables. Los estudios iniciales se centraron en la observación neuropatológica de cómo los circuitos neuronales se organizan en el cerebro de los humanos y otros animales. El advenimiento de la microscopía de fluorescencia y etiquetado genética amplió el alcance de estos estudios estructurales explorar la composición celular hasta el nivel de proteínas y de ADN.

Sin embargo, estos experimentos no se refirió a la función dinámica del cerebro, sólo la disposición estática. Para la comprensión de la actividad neuronal en curso, las técnicas populares se centran generalmente en el examen de la actividad electrofisiológica con registro intracelular. Las neuronas individuales de los cultivos disociados un modelo reduccionista útil, sin embargo, esta técnica está limitada por cortos intervalos de tiempo para la grabación de una sola célula. Este modelo también proporciona información limitada acerca de las otras células de la red. Secciones de cerebro de los roedores proporcionar más de un modelo realista, donde se mantiene la arquitectura cortical. Pero rebanadas tal, incluso cuando se cultivan, tienen una vida útil limitada y puede ser técnicamente difícil de mantener viva, conservando citoarquitectura ^2.

Otra tecnología que consiste en cultivar cultivos disociados neuronales en arrays de microelectrodos (también llamados electrodos múltiples arrays, AAM). Las neuronas se sembraron en los acuerdos ambientales multilaterales que han microelectrodos integrados en el fondo del plato. En el transcurso de tres semanas, estas culturas forman redes de neuronas completa con los axones, dendritas y cientos si no miles de conexiones sinápticas. Hay muchas ventajas de usar este sistema frente a otras tecnologías. Disociarse cultivos neuronales en los acuerdos ambientales multilaterales proporcionan un modelo simplificado con el que trabajar (en el orden de una columna cortical único en lugar de un cerebro intacto). Las células crecen en una monocapa de hacer cambios en la morfología fácil de controlar con técnicas de imagen. Actividad de la red puede ser manipulada con secuencias de estimulación eléctrica a través de múltiples electrodos de la matriz. Debido a que la red es pequeña, el impacto del estímulo se limita a las áreas observables, que no es el caso de las preparaciones intactas. Finalmente, los cultivos en los acuerdos ambientales multilaterales pueden sobrevivir durante más de un año in vitro que elimina las limitaciones de tiempo claro inherentes a las técnicas de cultivo de otros. ¹ Por lo tanto, las culturas de los AMUMA representan un modelo ideal para el estudio de la conectividad neuronal.

Nuestro laboratorio y otros en todo el mundo están utilizando esta tecnología para hacer preguntas importantes acerca de las redes neuronales. Actuales procesos neuronales están estudiando con este modelo incluyen la dinámica de la red, el desarrollo, el aprendizaje y la memoria, la plasticidad sináptica, la excitotoxicidad, la isquemia y la neurodegeneración. ^10.3 Los resultados de estos estudios podrían tener implicaciones importantes para el establecimiento de mejores tratamientos para enfermedades humanas, como las malformaciones congénitas, epilepsia , accidente cerebrovascular y la enfermedad de Alzheimer. El objetivo de este protocolo es proporcionar la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de las culturas y estimular a los acuerdos ambientales multilaterales. El objetivo final es proporcionar un medio para que los investigadores hacer preguntas fisiológicamente relevantes en los niveles celulares y la red que tal vez puede conducir a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción y, finalmente, el tratamiento de enfermedades que afectan a las neuronas y cómo se comunican.

El siguiente protocolo representa a más de 10 años de experiencia de nuestro laboratorio de cultivo, a grabar y estimular las redes neuronales en arrays de microelectrodos. Cada paso ha sido optimizado con el fin de conducir al desarrollo de largo sobrevivientes sanos redes neuronales. Las referencias se facilitará cuando se disponga mientras que algunos ajustes óptimos a fin de determinar empíricamente. Antes de iniciar el protocolo, obtener equipos y suministros, y preparar las soluciones que se enumeran en la sección "Materiales". La sección sobre "La disección del cerebro" se discuten brevemente, pero no se demuestra en el vídeo que acompaña como Diario de otros artículos visualizados Experimento tratará este tema ^11.

B. La disección del cerebro

1. Cerebros enteros se extraen de embriones de ratas de 18 días (E18). Cronometrada embarazadas ratas se anestesian con isoflurano inhalado y decapitado. Los embriones se retiran y se diseca de acuerdo con el GUID Consejo Nacional de Investigacióne para el cuidado y uso de animales de laboratorio con un protocolo aprobado por el IACUC la Universidad de Emory.
2. Mientras que la utilización de una técnica aséptica, el cerebro embrionario se retiran y se colocan en una solución equilibrada de Hank frío Sales (HBSS) en una placa de Petri estéril de 100 mm. El resto del protocolo de disección se produce bajo un microscopio de disección en una campana de flujo laminar para minimizar el riesgo de contaminación.
3. El cerebro de las ratas se transfieren de uno en uno a un segundo plato de Petri estéril con HBSS para la disección. Mientras está sumergido en HBSS, el tronco cerebral, el tálamo y el cerebelo se cortan y dividido en dos hemisferios son.
4. El tubérculo olfatorio se utiliza como un mango para asegurar el hemisferio mientras que suavemente eliminando las meninges.
5. La corteza es entonces despega de la base del hipocampo y el estriado y se almacena en un recipiente estéril de 15 mL cónico en la solución de hibernación en el hielo. ¹² Puesto que hay varios embriones por lo general, este procedimiento se repite en función de la cantidad deseada de los acuerdos ambientales multilaterales a ser plateado y la densidad celular deseada. Cortezas se combinan para el proceso de disociación celular como veremos a continuación. Cortezas se pueden almacenar a 4 ° C en una solución de hibernación hasta 24 horas antes de la disociación, con sólo una mínima pérdida de la viabilidad celular. Como alternativa a la utilización de tejido disecado en la casa, los tejidos disecados cerebro se pueden comprar a partir de fragmentos de cerebro ( www.brainbitsllc.com ).

C. MEA preparación y cortical disociación

1. La AMA se obtienen a partir de ALA Científicas ( www.alascience.com ), un proveedor para el fabricante, sistemas multi-canal. Existen varias configuraciones diferentes de los acuerdos ambientales multilaterales, con variaciones en la orientación del electrodo y el espaciado, la presencia o ausencia de un electrodo interno del suelo, presencia o ausencia de un anillo de cristal, y el tamaño del anillo de cristal. Para nuestros experimentos básicos que utilizan el estándar micro-electrodos matriz que contiene 60 electrodos en un 8 por disposición de cuadrícula 8, con un anillo de cristal. El nitruro de titanio diámetro del electrodo es de 30 micras y la distancia entre centros de electrodos es de 200 micras. Uno de los electrodos es más grande y funciona como la tierra o electrodo de referencia interno. Al manipular los acuerdos ambientales multilaterales, es de vital importancia que no hay objetos sólidos (por ejemplo, puntas de pipeta, pañuelos de papel, o los policías de goma) cada vez toque la parte interior del plato, ya que puede dañar los electrodos. Información más detallada sobre los acuerdos ambientales multilaterales y la manipulación se puede encontrar en el manual de usuario MEA ( www.multichannelsystems.com / products-mea / microelectrodo arrays.html- ).
2. En la noche antes de la preparación de células, los acuerdos ambientales multilaterales se enjuagan con agua desionizada y luego se deja en remojo en alcohol al 70% durante 15 minutos. Los platos se colocan en una campana de flujo laminar con la luz UV en la noche a la mañana. Para fines de manejo, cada AMA se coloca en un estándar de 100 mm placa de Petri estéril de poliestireno con las fechas y el etiquetado colocado en la placa de Petri. Es de destacar que otras técnicas de esterilización como el autoclave y la utilización de agua a 90 ° C se mencionan en el manual de MEA usuarios. Sin embargo, hemos descubierto empíricamente que el autoclave parece disminuir el número de veces que un acuerdo multilateral se pueden utilizar. Si vuelve a utilizar los acuerdos ambientales multilaterales que actualmente tienen las culturas, la materia orgánica debe ser eliminado. 300-400 l de tripsina al 0,25% en PBS se incubaron en la MEA a 35-37 ° C durante 20 minutos. La MEA se enjuaga con agua desionizada y luego inspeccionar con un microscopio de luz. Si la materia celular sigue siendo, entonces el paso de tripsina se repite hasta que limpia. Si el plato está limpio, y luego proceder con la etapa de esterilización que el anterior. En general, los acuerdos pueden ser reutilizados en múltiples ocasiones con los cuidados adecuados.
3. También en la noche anterior a la chapa, las tapas se preparan y MEA autoclave. Las tapas son hechas a medida, pero también se pueden comprar a partir de ALA-científico. Están hechos de politetrafluoroetileno de teflón y una membrana transparente (etileno-propileno fluorado de teflón) se extendía por la parte superior. La membrana permite la difusión de gases, pero limita la difusión de agua con lo que prácticamente elimina la necesidad de un ambiente húmedo y prevenir los efectos nocivos de la evaporación y la hiperosmolaridad ^1.
4. Una vez que la disección es completa, la preparación de MEA se continúa mediante la colocación de 100 l de polietilenimina (PEI) la solución en el centro de cada uno de los AMUMA. ¹³ En nuestras manos, la solución de PEI ofrece menos de agrupación de las células de la MEA que el uso de polilisina. El plato se deja reposar a temperatura ambiente en la campana de flujo laminar durante 30 minutos con los párpados ligeramente apoyado sobre los acuerdos ambientales multilaterales para evitar la evaporación. Como recordatorio, cualquier trabajo con la apertura MEA o tejido cerebral debe llevarse a cabo en una campana de cultivo celular estándar de flujo laminar para mini-minimizar el riesgo de contaminación.
5. La MEA se enjuaga tres veces con 1-2 ml de agua estéril con agua desionizada. El flujo laminar ideal de campana puesta en marcha se incluyen un aparato aspirador para eliminar el líquido de los platos. A punta de pipeta 200μl se puede conectar a la tubería de aspiración. No toque la superficie de la MEA mientras se aspira, ya que puede dañar los electrodos. Después del enjuague final, la MEA se deja secar por lo menos 30 minutos en la campana de flujo laminar.
6. Durante este período de secado, el proceso de disociación neuronal que se inicia mediante la colocación de la corteza en 2 ml de solución de papaína en 15 ml frasco estéril de plástico cónico. ¹ 50 l de DNAsa se ​​añade a la mezcla. El vial se coloca en un baño de agua a 35-37 ° C y se incuba durante aproximadamente 20 minutos. Golpee suavemente la solución cada 5 minutos para mezclar con cuidado de no introducir burbujas. La corteza debería empezar a tomar una apariencia difusa a medida que avanza la digestión.
7. La solución de papaína es cuidadosamente eliminado mediante pipeteo dejando la corteza en el frasco cónico de 15 ml. 2 ml de medio celular se añade a la corteza, se deja incubar durante 2-3 minutos y luego se retira con suavidad. Esto es para lavar cualquier residuo papaína, que también será inhibido por el suero en el medio. Otro 2 ml de medio celular se añade a la corteza y la muestra se agitaron a velocidad alta durante 5-10 segundos. Debe haber una solución turbia en el fondo del frasco cónico de 15 ml y no piezas restantes del cerebro. Por otra parte, trituración con 1 ml de medio por 3 veces con una mano la pipeta P-1000 puede ser utilizada para disociar el tejido. Para ^una trituración adecuada, cada golpe de pipeta debe tomar un segundo.
8. La solución se deja pasar suavemente a través de un colador de células estériles 40μm a través de la gravedad. Agregue lentamente la solución de células de una gota en un momento en el colador con un P-1000. Un plato de Petri estériles de 35 mm se utiliza para recoger la solución de células tensas.
9. La suspensión celular se transfiere de nuevo a un vial de 15 ml y medio celular se añade a un volumen final de 4,0 ml. ¹⁴
10. 500 l de un 5% w / v solución de BSA es cuidadosamente por capas en el fondo del frasco cónico de 15 ml con una P-1000. ¹⁴ Este se desplazan hacia arriba solución de células que contienen en el vial.
11. La solución de células con BSA en capas en la parte inferior se centrifuga durante 6 minutos a 200 xg para eliminar los residuos pequeños y el contenido intracelular potencialmente tóxicos. ¹⁴
12. Durante la etapa de centrifugación de células, los acuerdos ambientales multilaterales son visualmente evaluados para asegurar que estén completamente secos. 20 l de solución de laminina son cuidadosamente colocados en el centro de la MEA asegurar que todos los electrodos están cubiertos. ¹ Evite introducir burbujas de aire en esta solución, ya que puede conducir a una preparación inadecuada de la superficie del electrodo. Si la AMA no está completamente seco, entonces la caída de la laminina se extenderá por todo el plato que podría hacer más difícil la adecuada localización de las células sobre los electrodos en placas. Este paso es muy delicada y tiene el potencial de dar lugar a daños en la superficie de MEA con mano temblorosa o la prescripción en la atención.
13. Las tapas de teflón se colocan en los AMUMA en este punto para evitar la evaporación de la laminina. La colocación de la tapa también es delicada. Una tapa sólo debe ser colocado o retirado cuando la MEA se encuentra en una superficie completamente plana. De lo contrario, las fuerzas adicionales ejercida por una superficie irregular puede romper el vidrio inferior de la matriz de éste no podrá utilizarse. El plato se coloca en la incubadora durante 20 minutos.
14. Mientras que la laminina es vinculante para el plato, el frasco cónico de 15 ml que contiene las células se retira de la centrífuga y se transfiere de nuevo a la campana de flujo laminar. Una pastilla debe ser visible en la parte inferior del vial. El sobrenadante se retira cuidadosamente con una solución estéril de 5 ml pipeta serológica de plástico. Guardar el sobrenadante en caso de que el proceso de centrifugación fue incompleta. El pellet se resuspende entonces con suavidad, ya sea por trituración con una P-1000 o un torbellino rápido en 300-500 l de medio celular en función del rendimiento esperado. 10 l de suspensión de células se retiran y se colocan en un hemocitómetro para determinar la concentración de células. Si el rendimiento es bajo, analizar el sobrenadante bajo el microscopio para determinar si el paso de centrifugación fue incompleta. Centrifugación será necesario repetir. Si el rendimiento es alto, entonces una dilución puede ser necesario para contar más precisa. La densidad celular capa puede variar desde 5.000 a 300.000 células por MEA. Calcular una dilución de modo que el número deseado de células de revestimiento se encuentra en un volumen final de 15 a 20 l. Por lo general uso una concentración final de 1000 a 3000 células por microlitro. Un par de cortezas típicamente rendir entre 10 y 15 millones de células. Este número puede ser ligeramente menor si se utiliza la trituración.
15. Por este tiempo, tque laminina de incubación en el MEA debe ser completa. La tapa de teflón se retira de la AMA y la mayor parte de la caída de la laminina es aspirado al vacío o una pipeta de distancia. Entonces l 15-20 de la suspensión celular deseado inmediatamente pipeta en el área residual húmeda de la laminina. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en este pequeño volumen de suspensión celular como burbujas de aire pueden evitar que las células uniformemente que cubre todos los electrodos. La tapa es ligeramente sustituido y la MEA es cuidadosamente colocado de nuevo en la incubadora durante 30 minutos. El plato es entonces inspeccionado bajo el microscopio de luz para asegurarse de que las células se han adherido y cubrir todos los electrodos. Si todos los electrodos no están cubiertas, entonces más células se pueden añadir y el MEA se vuelve a colocar en la incubadora con tapa para permitir que estas nuevas células a adherirse. Si un tubo de la suspensión celular se usa más que unos minutos después de estar sentado tranquilo, asegúrese de remover suavemente para resuspender células establecidas. Una vez que la cobertura del electrodo adecuado se logra, entonces el plato lentamente inundada con 1 ml de agua tibia (35-37 ° C) medio celular. La tapa de teflón y se sustituye el plato se vuelve a colocar en la incubadora. La campana de flujo laminar seque bien y rápido los volúmenes y los volúmenes de laminina pequeña de células en suspensión una vez en el MEA así que tenga cuidado de mantenerlos cerrados con las tapas de teflón. El ambiente ideal para la incubadora de sellado acuerdos ambientales multilaterales es del 5% de CO _2, 9% O ₂ y el 65% de humedad a 35-37 ° C. Baja tensión de oxígeno es importante para cultivos a largo plazo, reduciendo el daño oxidativo. ¹² Mantener la humedad del 65% reduce la evaporación a través de la membrana de teflón (en comparación con ningún control de la humedad) y permite MEA electrónica que se utilizará en la incubadora, sin daño de la condensación de agua (como con una normal incubadora humidificada a la saturación).

D. El cambio medio celular y el cuidado de cultivos disociados de los acuerdos ambientales multilaterales

1. El día después de la siembra de células, inspeccione el MEA bajo el microscopio de luz. Si el color del medio sigue siendo melocotón a rojo en el color y hay una cantidad limitada de desechos celulares y muerte celular, el cambio medio del primer se puede retrasar para otro día. Sin embargo, si el medio está comenzando a aparecer más naranja o amarillo en el color y / o existe una gran cantidad de restos celulares y muerte celular, a continuación, cambiar el medio. Todos los cambios deben ocurrir en medio de una campana de cultivo celular estándar de flujo laminar.
2. El cambio de primer medio consiste en retirar la tapa de la MEA, la aspiración de distancia todos los del medio en el plato, en sustitución de la cantidad extraída con un medio de células frescas, y volviendo a poner la tapa. Vuelva a colocar la totalidad del importe del medio celular en el cambio de primer medio para eliminar los residuos celulares remanente del proceso de recubrimiento. Subsiguientes cambios a medio sólo debe aspirar distancia aproximadamente la mitad del medio seguido de sustitución de la cantidad extraída con un nuevo medio. Esto permite que algunos de los factores de crecimiento que se han secretado en el medio celular para permanecer con las células de mantener un ambiente más óptimo de crecimiento. Si la parte inferior de la tapa se contamina durante el proceso de cambio de medio, o si la tapa muestra signos de daño o suelta, a continuación, utilizar una tapa autoclave nuevo. Medio de células se pueden almacenar en la incubadora en un recipiente estéril con una tapa personalizada modificada (que tiene un teflón (etileno-propileno fluorado) de la membrana para permitir el intercambio gaseoso). Medio celular también se puede almacenar a 4 ° C, pero cálido y equilibrar esta en la incubadora antes de medio cambiante.
3. Retirar y sustituir aproximadamente la mitad de la media en un plato dos veces por semana. Algunas preparaciones de células puede conducir a cambios de color más rápida en el medio provoca la necesidad de cambios más frecuentes. Si el medio se observa a ser de color amarillo, a continuación, cambiar el monto total del medio. Rápida transición a amarillo también puede ser el signo de contaminación en inspeccionar el plato bajo el microscopio de luz en busca de signos visuales de infección.
4. Dependiendo de las condiciones de experimentación y una técnica estéril, las culturas que han sido cuidadosamente cuidada puede sobrevivir durante más de un año ^1.

E. Registro de los acuerdos ambientales multilaterales

1. Cada MEA tiene 59 electrodos de registro y un electrodo de tierra interna. Existen varios sistemas de grabación comercial disponible, así como versiones personalizadas hechas. Los vendedores incluyen sistemas multi-canal, Tecnologías de Tucker Davis, Biosystems Axion, Alpha Med Científico MED64, Plexon, Biosystems Ayanda y biológicos. Nuestro laboratorio en la actualidad utiliza una configuración comercial de sistemas multi-canal, un diseño personalizado del sistema basado en Windows llamado NeuroRighter ^15, y un diseño personalizado del sistema basado en Linux llamado MeaBench ^16. Cada uno de estos sistemas es capaz de grabar a partir de los acuerdos ambientales multilaterales (sistemas multi-canal) con un preamplificador de sistemas multi-canal. Una instalación comercial de las tecnologías de Tucker Davis también está en uso. Este protocolo se demostrará la grabación de los acuerdos ambientales multilaterales con NeuroRighter. NeuroRighter software es de código abierto y disponible para su descarga gratuita, junto con los diseños de hardware en NeuroRighter grupos de Google. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Culturas de los acuerdos ambientales multilaterales tomar 2-3 semanas para llegar a un estado constante de actividad. ^17,18 Esta actividad incluye los potenciales de acción espontáneos y de gran cultura-estallido (un aluvión de potenciales de acción que se propaga a través de una cultura sinápticamente). La naturaleza del experimento sin embargo determinará el número ideal de días in vitro antes de grabar.
3. La actividad neuronal depende de condiciones ambientales ideales como la temperatura y el pH. ¹ Como resultado, nuestra grabación se lleva a cabo en la incubadora como se describió anteriormente. Si los experimentos de corto (<30 minutos) se proyectan, también hay un módulo de calefacción disponibles en el mercado que puede ser conectado al preamplificador MCS para mantener la temperatura ideal de los AMUMA.
4. Para iniciar la grabación, un MEA (aún en su placa de Petri) se transfieren cuidadosamente de la incubadora de almacenamiento para la grabación de la incubadora. Mantenga la parte inferior del plato en paralelo al suelo. Evite movimientos rápidos con la MEA o golpes en la MEA, ya que pueden separar la cultura del sustrato. La MEA se extrae de la placa de Petri y se coloca en el preamplificador de grabación. Coincidir con el electrodo de masa interna en los platos que están demostrando con el electrodo de masa en el preamplificador (canal CR15 para el preamplificador MCS). Limpie los contactos en todo el perímetro de la AMA con un pañuelo de papel o algodón humedecido en etanol al 70% para eliminar huellas dactilares u otros desechos que pueden obstaculizar una buena conexión. Después de asegurarse de que la AMA está sentada correctamente, la tapa del preamplificador entonces se baja y trabada en su lugar. Los contactos de la tapa preamplificador debe apoyarse firmemente en los electrodos de contacto de la MEA. Inspeccione visualmente la alineación de contacto y ajustar con un hisopo de algodón si es necesario. Coloque el preamplificador en el dispositivo de Peltier en la incubadora. Este consiste en dos placas de cobre con una bomba de calor Peltier termoeléctrico situado entre ellos. Corremos este alrededor de 5 V, para eliminar parte del calor producido por los circuitos de preamplificación. Esto evita que se forme condensación en el interior de la tapa de la membrana de teflón. La condensación podría indicar daño de la cultura por el aumento de la osmolaridad del medio en contacto con las células, debido a la evaporación. Al asegurar que el preamplificador y el medio son uno o dos grados por debajo de la temperatura de la incubadora de aire, cambios en la osmolaridad se reducen al mínimo.
5. Encienda la fuente de alimentación a NeuroRighter y abrir el software en la estación de trabajo. Ajustar la configuración de NeuroRighter in vitro con las configuraciones adecuadas de software / hardware también en su lugar. Seleccione el número de electrodos en el software. Con el fin de reducir la cantidad de ruido de fondo, una cámara digital de banda del filtro de paso se puede habilitar. Seleccione un archivo de datos con el conmutador de registro de datos si se va a guardar para su posterior análisis. Activar el botón de inicio una vez que todos los ajustes apropiados son los elegidos.
6. La pantalla debe mostrar corriendo rastros de la actividad y el ruido de fondo. Potenciales de acción y ocasionales ráfagas de plato de gama de la actividad debe ser visible. En la sección siguiente sobre la grabación de la solución de problemas de los acuerdos ambientales multilaterales discutirá varios problemas comunes, si la actividad se espera no se visualiza.
7. La vista de la pantalla se puede cambiar al modo de detección de pico ("Dilo WFMS pestaña) donde los potenciales de acción se muestran estáticamente como se presentan en ventanas de tiempo de 3 ms. Para un canal dado, real potenciales de acción extracelular debe durar aproximadamente 1 ms y debe disparar repetidas veces en la misma dirección (positiva o negativa). Ocasionalmente, dos o más neuronas puede ser visible en el mismo electrodo de diferente polaridad. Picos con un curso corto tiempo y la polaridad de las variables se artefacto probable. La figura 1 muestra un gráfico de mapa de bits de datos pico.
8. La vista de la pantalla se puede cambiar a los potenciales de campo local (LFPs) para un vistazo a la localización del origen de la explosión de actividad. Este tipo de ajuste puede ser más útil cuando se graba en vivo desde monocapas han LFPs débil. Es de destacar que algunos preamplificadores (uno de ellos se utiliza de sistemas multi-canal) tienen filtros de paso alto de 10 Hz que atenuar las bajas frecuencias ritmos LFP.

F. Estimular las redes neuronales en los acuerdos ambientales multilaterales

1. El mismo 59 electrodos de registro en un MEA también puede ser utilizado para estimular la cultura. La naturaleza del experimento será determinar el grado de estimulación. NeuroRighter ofrece flexibilidad para el diseño experimental de estimulación, ya que es código abierto. ¹⁵
2. El reto de impulsar la cultura es que el estímulo crea un artefacto que puede durar varios milisegundos. Este artefacto puede ser lo suficientemente grande como para activar la detección de pico oscuro y las respuestas de estímulo. NeuroRighteR utiliza el algoritmo SALPA para minimizar y, en algunos casos eliminar esencialmente el artefacto de estímulo. ¹⁹
3. Para estimular la red neuronal en la EM, el algoritmo de tren SALPA en la pestaña "Ajustes de grabación" para limitar el artefacto de estimulación. SALPA activar en la pestaña "Configuración en línea". Seleccione un nombre de archivo y haga clic en el botón Inicio, como previamente para comenzar la grabación. A continuación, haga clic en "Estimulación" ficha. Hay muchas opciones para la creación de la estimulación en esta página.
4. Un experimento simple es el de estimular un electrodo y ver la respuesta de la cápsula, utilizando la sección de "lazo abierto". Seleccione la velocidad, voltaje, fase de ancho y el número de canales. Pulse el botón de inicio en la sección de lazo abierto. Las respuestas a esta estimulación se puede visualizar en la pestaña principal de 'picos' y la pestaña 'Dilo WFMS y analizados en los archivos de datos.
5. En tiempo real, las explosiones pueden ser visualizados en un tiempo-bloqueado a un estímulo hertz uno de 0,5 V a través de múltiples electrodos. La figura 2 muestra un gráfico de trama de una respuesta post-estímulo. Observaciones previas han demostrado que hay dos tipos de estímulo evocado por la actividad:. Directa evoca potenciales de acción (DAP) y los potenciales evocados sinápticamente acción (PAE) ²⁰
6. Neuronas en cultivo tienen estallidos espontáneos de la actividad. Para algunos experimentos, este tipo de explosión puede interferir con el intento de controlar la dinámica de la red. Curiosamente, distribuidos en 1.2 Hz de estimulación por electrodos pueden empezar a suprimir la actividad de estallar en una red neuronal en un AMUMA. ²¹

G. Solución de problemas de grabación de los acuerdos ambientales multilaterales

1. No potenciales de acción o presentar ruptura en el MEA cuando el software se convierte en:
   1. Es la vieja cultura lo suficiente? Los potenciales de acción debe ser visible hacia el final de la primera semana in vitro. Ruptura se produce alrededor de dos a tres semanas in vitro.
   2. Es el hardware de recibir el poder? El sistema utiliza dos NeuroRighter 6V de plomo-ácido para alimentar el hardware. El interruptor de encendido debe estar en la posición de encendido y las pilas cargadas.
   3. Es la cultura viva? A veces esto puede ser difícil de determinar, especialmente en la cultura densa o más debido a la proliferación de células gliales. Sin embargo, uno puede buscar las neuronas sanas que aparecen (los cuerpos brillantes, elípticas en forma de células bajo el microscopio de contraste de fase) y enteros (no fragmentada) los procesos celulares. También puede haber un problema con la cultura si no hay evidencia de contaminación visible o la velocidad de degradación medio (convirtiéndose en ácido después de sólo 1 a 2 días entre los cambios de media).
   4. ¿Cuál es la impedancia del electrodo? Más de usos múltiples, los electrodos micro o el aislamiento de un MEA puede degradar. NeuroRighter tiene la capacidad para evaluar la impedancia del electrodo. ¹⁵ lecturas de impedancia normal alrededor de 1kHz debe oscilar entre 10.000 y 100.000 ohmios. Mayores impedancias sugieren lleva roto o electrodos y las lecturas de menos de 10.000 Ohms sugieren aislamiento con fugas.
   5. Es el preamplificador conectado a la placa de hardware? El preamplificador debe tener un cable de salida que se conecta a la placa de hardware. El preamplificador también tiene 4 tarjetas estimulador pequeños que también se conectan a la placa principal y el hardware son importantes para la estimulación solamente.
   6. Tiene la configuración del software NeuroRighter ha cambiado? La configuración de hardware en el software debe ser correcto para la grabación de trabajar. Instalación y configuración de versiones actualizadas de varios usuarios pueden provocar este cambio.
   7. Es la MEA a 35-37 ° C? Las temperaturas más frías puede llevar a una reducción en la actividad espontánea de las redes corticales. Esto no suele ser un problema ya que la grabación se produce dentro de la incubadora con temperatura controlada, sin embargo se debe permitir el equilibrio de temperatura si el MEA ha estado fuera de la incubadora por más de unos segundos.
   8. Tiene el medio ha cambiado en las últimas horas? Hemos observado las culturas a menudo dejar de disparar durante varias horas después de comer. Por lo tanto, lo mejor es llevar a cabo experimentos antes de la alimentación.
2. Electrodo con la saturación excesiva de ruido de fondo de la ventana de grabación:
   1. Es el contacto pin preamplificador con el electrodo en el MEA suficiente? Este problema puede ser causado por un alfiler alineados en la tapa del preamplificador, un pequeño pedazo de basura, una gota de medio, una superficie del electrodo, o que las de una membrana clara superposición de la tapa. Inspeccionar el contacto de estos temas es el primer paso. Ajuste el perno con un algodón empapado en alcohol al 70% a veces puede mejorar el contacto, especialmente si no había una gota de medio que sea necesario la limpieza de distancia. La señal puede parecer peor hasta que se evapore el etanol. </ Li>
   2. ¿El electrodo parecen ser dañado? Visualización en el microscopio de luz a veces puede revelar agrietados o picados aislamiento del electrodo que lleva a este tipo de artefacto.
   3. Son las almohadillas de contacto desgastado o rayado? A veces puede haber varios contactos de electrodos en el AMUMA que son difíciles de optimizar. Esto es más común después de múltiples usos MEA y revestimientos. Un hilo de oro impregnadas espaciador de goma lleva a cabo sólo en la dirección de su espesor de 0,5 mm y puede mejorar el contacto con el preamplificador pin MEA. Este material está disponible en Fujipoly y puede ser lindo para adaptarse a la MEA y la tapa.
3. Todo MEA muestra excesivo ruido de fondo:
   1. Es el MEA en la orientación correcta a fin de que el electrodo de masa en la MEA en contacto con el pin de tierra del preamplificador? Si la AMA está en la orientación correcta, asegurando que no hay problemas contacto con el suelo (2 c. supra) también es importante tener en cuenta. Es el canal CR15 a tierra con un cable corto al chasis preamplificador? Utilizando el puente a tierra a través de las resistencias internas kOhm 30 puede resultar en exceso de ruido.
   2. ¿Existe la interferencia de las luces que rodean, fuentes de alimentación u otras piezas de equipo? Una de las formas más comunes de interferencia es de 60 Hz de las luces y equipos. El sistema de grabación debe estar correctamente conectado. Blindaje de los cables expuestos también puede ser útil en la reducción de la interferencia de fondo.

Resultados representante

Figura 1. Se trata de una trama de trama de 2 minutos de la actividad espontánea de una red neuronal. Cada punto negro representa un potencial de acción. Dos ráfagas de actividad se indican con las flechas azules. La respuesta a múltiples electrodos es una función de la conectividad de red.

Figura 2. He aquí una gráfica de trama de 16 segundos de estímulo evocado por la actividad. Estrellas rojas representan los estímulos. Las flechas rojas indican que cinco estímulos inducidos con éxito las explosiones de la actividad sináptica a través de múltiples electrodos. De vez en cuando, un estímulo no produce una explosión, aquí en la flecha azul.

Discussion

Este protocolo muestra instrucciones acerca de cómo la cultura y mantener las redes neuronales en arrays de micro-electrodos, así como una introducción a la grabación de las redes neuronales y estimulante. Algunos de los problemas más comunes durante la grabación de los acuerdos ambientales multilaterales también se discutieron en la sección de solución de problemas MEA. Hay variaciones ocasionales en el protocolo como discutido a lo largo y muchas veces estos cambios son utilizados para optimizar las condiciones específicas requeridas por ciertos diseños experimentales.

Aunque el sistema de registro y estimulación que aquí se presenta se compone de nuestro diseño personalizado NeuroRighter ¹⁵ con el previo MCS, hay varios otros sistemas que pueden proporcionar una interfaz con las redes neuronales. La elección de una configuración particular dependerá de las necesidades experimentales específicas.

Grabación simple y ejemplos de estimulación fueron en el presente Protocolo sin embargo, estas culturas de los acuerdos ambientales multilaterales se puede utilizar para proporcionar información sobre cuestiones complejas sobre la actividad sináptica y la conectividad de la red neuronal. Como se mencionó anteriormente, los trabajos en curso es la utilización de esta tecnología para estudiar procesos como la plasticidad celular, el desarrollo, la excitotoxicidad y neurodegeneración. ^6-10 Por ejemplo, una publicación reciente de nuestro laboratorio mostraron objetivo reproducible aprendizaje dirigido in vitro en tiempo real con la estimulación de circuito cerrado en respuesta a la actividad actual de la red neuronal ^3.

Aunque las culturas MEA son a menudo meticuloso y delicado, gracias a su sencillez y accesibilidad (en comparación con animales intactos), que proporcionan un poderoso modelo para estudiar la actividad neuronal a nivel de red.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.