Как культуре, запись и стимулировать нейронных сетей на микро-электрод массивы (МЭС)

Summary

Этот протокол обеспечивает необходимую информацию для создания, забота о, запись, и электрически стимулирует культур на МПС.

Abstract

За последние века, многие нейрофизиологи по всему миру, посвятивших свою жизнь к пониманию, как нейронные сети работают и почему они перестают работать при различных заболеваниях. Исследования включили нейропатологических наблюдения, флуоресцентной микроскопии с генетической маркировки и внутриклеточной регистрации в обоих диссоциированных нейронов и нарезать препаратов. Этот протокол описывает другой технологии, которая включает в себя растущую диссоциированных нейронов культур на микро-электрод массивов (также называемый многоэлектродной массивы, МЭС).

Есть несколько преимуществ использования этой системы по сравнению с другими технологиями. Диссоциированных нейронов культур на МПС обеспечить упрощенную модель, в которой сетевой активности можно управлять с помощью электрических последовательности стимуляции через несколько электродов массива. Поскольку сеть невелика, влияние стимуляции ограничивается наблюдаемой области, которая не относится к нетронутым препаратов. Клетки растут в монослое внесении изменений в морфологии легко наблюдать с помощью различных методов визуализации. Наконец, культур на МПС могут выживать в течение более года в пробирке, который удаляет любые четкие ограничения времени присуща с другими методами культивирования ^1.

Наши лаборатории и других людей во всем мире используют эту технологию, чтобы задавать важные вопросы о нейронных сетях. Цель этого протокола заключается в предоставлении информации, необходимой для создания, забота о, запись, и электрически стимулирует культур на МПС. Экстракорпоральное сети обеспечивают средства для просят физиологически соответствующие вопросы в сети и клеточном уровнях, ведущих к более глубокому пониманию функции мозга и дисфункции.

Protocol

А. Введение

Есть миллиарды нейронов в человеческом мозге. Каждый из этих нейронов может иметь сотни и даже тысячи соединений зачастую с различными клетками. Эти связи гавани сигналы, которые позволяют нам ходить, играть фортепиано, ездить на велосипеде, смеяться, плакать, и запомнить. За последние века, многие нейрофизиологи по всему миру, посвятивших свою жизнь к пониманию, как нейронные сети работают и почему они перестают работать при различных заболеваниях.

Есть много инструментов, можно использовать при приеме на этом, казалось бы невыполнимой задачей. Первоначальные исследования были сосредоточены на нейропатологических наблюдение о том, как нейронные цепи организованы в мозг человека и других животных. Появление флуоресцентной микроскопии и генетической маркировки расширена сфера применения этих структурных исследований изучение клеточного состава до уровня белков и ДНК.

Но эти эксперименты не адрес динамической функции головного мозга, только статическое договоренности. Для понимания текущей нейронной активности, популярные методы как правило, сосредоточены на изучении электрофизиологических деятельность с внутриклеточной регистрации. Одноместный нейронов диссоциированных культурах обеспечивают полезную модель редукционизма, однако этот метод ограничен короткие промежутки времени для записи от отдельных клеток. Эта модель также предоставляет ограниченную информацию о других клеток в сети. Мозг ломтики от грызунов обеспечивают больше реалистичной модели, где корковых архитектуры сохраняется. Но такие кусочки, даже тогда, когда культурная, имеют ограниченную продолжительность жизни и могут быть технически сложно поддерживать, сохраняя cytoarchitecture ^2.

Еще одна технология включает в себя растущую диссоциированных нейронов культур на микро-электрод массивов (также называемый многоэлектродной массивы, МЭС). Нейроны высевали на МПС, которые микроэлектродов встроенных в нижней части блюда. В течение трех недель, эти культуры являются сети нейронов в комплекте с аксонов, дендритов и сотни если не тысячи синаптических связей. Есть несколько преимуществ использования этой системы по сравнению с другими технологиями. Диссоциированных нейронов культур на МПС обеспечить упрощенную модель, с которой на работу (по заказу одной корковой колонки, а не интактном мозге). Клетки растут в монослое внесении изменений в морфологии легко наблюдать с помощью различных методов визуализации. Сетевая активность можно управлять с помощью электрических последовательности стимуляции через несколько электродов массива. Поскольку сеть невелика, влияние стимуляции ограничивается наблюдаемой области, которая не относится к нетронутым препаратов. Наконец, культур на МПС могут выживать в течение более года в пробирке, который удаляет любые четкие ограничения времени присуща с другими методами культивирования. ¹ Таким образом, культур на МЭС представляют собой идеальную модель для изучения нейронных соединений.

Наши лаборатории и других людей во всем мире используют эту технологию, чтобы задавать важные вопросы о нейронных сетях. Текущий нейронных процессов изучается с этой моделью могут быть отнесены сетевые динамики, развития, обучения и памяти, синаптической пластичности, эксайтотоксичность, ишемии и нейродегенерации. ^3-10 Выводы из этих исследований может иметь значительные последствия для установления лучших методов лечения человеческих заболеваний, как врожденные пороки развития, эпилепсия , инсульт и болезни Альцгеймера. Цель этого протокола заключается в предоставлении информации, необходимой для создания, забота о, записи с и стимулирование культур на МПС. Конечная цель заключается в предоставлении средств для исследователей спросить физиологически соответствующие вопросы на клеточном и сетевых уровней, которые, быть может привести к лучшему пониманию функции мозга и дисфункции и в конечном счете, лечение заболеваний, которые влияют на нашу нейронов и как они общаются.

Следующий протокол представляет более 10 лет опыта работы с нашей лаборатории в культивировании, записи с и стимулирования нейронных сетей на микро-электрод массивов. Каждый шаг был оптимизирован таким образом, чтобы привести к развитию долго сохранившихся здоровых нейронных сетей. Ссылаются при условии, если таковые имеются, хотя некоторые оптимальные настройки мы определяется опытным путем. До начала протокола, получать оборудование и материалы и подготовить решения, которые перечислены в разделе «Материалы». Раздел «Мозг Вскрытие" будет кратко обсуждаться, но не показана в сопровождающее видео и другие Журнал Визуализация статьи Эксперимент эта тема ^11.

Б. Мозг Вскрытие

1. Всего мозга извлекаются из эмбриональных крыс день 18 (E18). Временный беременных самок крыс анестезируют ингаляционными изофлуран и обезглавлены. Эмбрионы удаляются и расчлененные по Guid Национального исследовательского советае для ухода и использования лабораторных животных с использованием протокола утвержденной Университета Эмори IACUC.
2. Хотя использованием асептических условиях, эмбрионального мозга удаляются и помещаются в Сбалансированный Соли холодной Хэнка решение (HBSS) в 100 мм стерильную чашку Петри. Остальная часть протокола вскрытия происходит при вскрытии микроскоп в ламинарном боксе, чтобы минимизировать риск заражения.
3. Крыса мозг передаются по одному за раз, чтобы второй стерильную чашку Петри с HBSS для вскрытия. Хотя погружены в HBSS, ствола мозга, таламуса и мозжечка срезать и полушарий делятся пополам.
4. Обонятельный бугорок используется как ручка для обеспечения полушарии, мягко удаляя мозговых оболочек.
5. Коры затем очищенные от основной гиппокампе и полосатом теле и хранится в стерильной 15 мл коническую трубку в спящий решение на льду. ¹² Поскольку Есть правило, несколько эмбрионов, эта процедура повторяется в зависимости от желаемого количества МЭС быть покрыты и желаемой плотности клеток. Коры объединяются для процессов клеточной диссоциации, как описано ниже. Коры можно хранить при температуре 4 ° С в растворе зимовать на срок до 24 часов до диссоциации только с минимальной потерей жизнеспособности клеток. В качестве альтернативы использованию тканей расчлененный в доме, расчлененный мозговой ткани можно купить от мозга битов ( www.brainbitsllc.com ).

С. МЭС подготовки и корковых диссоциации

1. МЭС получаются из ALA Scientific ( www.alascience.com ), поставщика для производителя, многоканальных систем. Есть несколько различных конфигураций для МПС с изменениями в ориентации электродов и расстояния, наличие или отсутствие внутренней боковой электрод, наличие или отсутствие стеклянное кольцо, и размер стекла кольцо. Для наших основных экспериментов мы используем стандартные микро-электрод массив, содержащий 60 электродов в 8 на 8 сетке договоренности с маленького кольца стекла. Электрод нитрида титана диаметром 30 мкм, а расстояние между электродами центров составляет 200 мкм. Один из электродов больше и функционирует как землю или внутреннего электрода сравнения. При работе с МПС, жизненно важно, что никакие твердые предметы (например, наконечники, салфеток, или резиновые полицейские) когда-нибудь прикоснуться к внутренней стороне блюда, как это может повредить электроды. Более подробную информацию о МПС и обращение может быть найден в МЭС руководство пользователя ( www.multichannelsystems.com / продуктов-измерений / микроэлектрода-arrays.html ).
2. Вечером перед ячейки подготовки, МПС промывают деионизированной водой, а затем позволил, чтобы впитать в 70% этаноле в течение 15 минут. Блюда затем помещается в ламинарном боксе с УФ-свет на ночь. Для работы с целями, каждое МЭС помещается в стандартный 100 мм стерильную чашку Петри полистирола с датами и маркировки размещены на чашки Петри. Следует отметить, что другие методы стерилизации автоклавированием в том числе и использования воды при 90 ° C, упоминаются в руководстве МПС пользователей. Тем не менее, у нас есть эмпирически установлено, что автоклавирования, кажется, уменьшить количество раз, что МЭС могут быть использованы. Если вы повторно МПС, которые в настоящее время имеют культур, то органические вещества должны быть удалены. 300-400 мкл 0,25% трипсина в PBS, инкубируют на МЭС при 35-37 ° С в течение 20 минут. МЭС промывают деионизированной водой, а затем проверку с светового микроскопа. Если сотовая вопрос все еще остается, то трипсина шаг повторяется до чистой. Если блюдо чистого, то приступить к стерилизации шаг как указано выше. В общем, МПС, могут быть использованы несколько раз с адекватной медицинской помощи.
3. Также на вечер до обшивки, MEA крышки готовятся и в автоклаве. Веки на заказ, но также может быть приобретен у ALA-научный. Они изготовлены из политетрафторэтилена тефлона и иметь четкую мембраны (фторированные этилен-пропилен тефлон) тянулись вверх. Мембраны позволяет диффузии газов, но ограничивает диффузию воды тем самым фактически устраняя необходимость влажной атмосфере и предотвращения вредного воздействия испарения и гиперосмолярности ^1.
4. После вскрытия выше завершения МЭС подготовки продолжается путем размещения 100 мкл полиэтиленимина (PEI) раствор в центре каждого МЭС ^13. В наших руках, PEI решение обеспечивает меньше кластеров клеток в МЭС, чем при использовании полилизином. Блюдо может сидеть при комнатной температуре в ламинарном боксе в течение 30 минут с крышками, слегка опираясь на МПС, чтобы предотвратить испарение. Напомним, что любая работа с открытыми МЭС или мозговой ткани должно проходить в стандартный капот культуре клеток ламинарного потока к миниMize риск заражения.
5. МЭС затем промыть 3 раза с 1-2 мл стерильной деионизованной воды. Идеальный ламинарный поток капот настройки будет включать в себя аспиратор устройства для удаления жидкости из посуды. 200 мкл стерильной кончика пипетки может быть присоединен к аспиратор труб. Не прикасайтесь к поверхности МЭС при аспирационных так как это может повредить электроды. После окончательного полоскания, MEA оставляется на просушку в течение по крайней мере 30 минут в ламинарном боксе.
6. В этот период сушки, нейронных процессов диссоциации, созданные размещения коры на 2 мл раствора папаина в 15 мл стерильного конической флакон пластика. ¹ 50 мкл ДНКазы добавляется к смеси. Флакон помещается в водяной бане при температуре 35-37 ° С и выдерживают в течение примерно 20 минут. Аккуратно нажмите на решение каждые 5 минут для смешивания будьте осторожны, чтобы избежать введения пузыри. Коры должны начать брать на нечеткой вид, как пищеварение продолжается.
7. Решение папаин, затем осторожно удаляют с помощью пипетки оставляя коры в 15 мл конические пробирки. 2 мл клеточной среде добавляется в коре, инкубировали в течение 2-3 минут, а затем аккуратно удалить. Это необходимо для вымывания остаточных папаин, который также будет тормозится сыворотки в среду. Другой 2 мл клеточной среде добавляется в коре, и это образец затем встряхивали на высокой скорости в течение 5-10 секунд. Там должно быть мутный раствор в нижней части флакона 15 мл конические и не оставшиеся части мозга. Кроме того, растирания с 1 мл среды в 3 раза использованием P-1000 ручных пипетки может быть использована для диссоциирующего ткани. ¹ Для правильной растиранием, каждый удар пипетки должны принять одну секунду.
8. Затем раствор пропускается мягко через стерильный фильтр 40 мкм ячейке через гравитацию. Медленно добавляйте клетка решение одной капле в то время, в сито с P-1000. 35 мм стерильную чашку Петри, используется для сбора напряженными решение клетки.
9. Клеточной суспензии затем переведен обратно в 15 мл коническую пробирку и клеточной среде добавляется в конечном объеме 4,0 мл ^14.
10. 500 мкл 5% м / о раствор БСА затем тщательно слоями в нижней части 15 мл коническую пробирку с P-1000. ¹⁴ Это будет вытеснять ячейки раствор, содержащий вверх во флаконе.
11. Клетка решение с BSA в слоистых дно затем центрифугировали в течение 6 минут при 200 мкг для удаления мелких частиц мусора, и потенциально токсичных внутриклеточного содержимого ^14.
12. На этапе центрифугирования клетки, МПС визуально оценивается как гарантировать, что они полностью не высохнут. 20 мкл раствора ламинин затем осторожно помещают в центр МЭС обеспечения, что все электроды покрыты. ¹ Избегать введения пузырьков воздуха в это решение, поскольку это может привести к недостаточной подготовки поверхности электрода. Если MEA не полностью высохнуть, затем каплю ламинин будет распространяться по всему блюду потенциально делает его труднее адекватно локализовать клеток в течение электродов при металлизации. Этот шаг очень деликатный и есть потенциал, чтобы привести к повреждению поверхности МЭА с нетвердой рукой или перерыва в внимание.
13. Тефлон крышками помещаются на MEA в этот момент, чтобы предотвратить испарение ламинин. Размещение крышка также деликатный. Крышка должна быть размещена только или удалены, когда МЭС находится на совершенно плоской поверхности. В противном случае, дополнительные силы, действующие на неровную поверхность может треснуть стекло нижней части массива, что делает его непригодным для использования. Блюдо затем помещаются в инкубатор на 20 минут.
14. Хотя ламинин являются обязательными к блюду, 15 мл коническую флакон, содержащий клетки удаляется из центрифуги и переданы обратно в ламинарном боксе. Гранулы должны быть видны в нижней части флакона. Супернатант тщательно удалены с стерильный 5 мл пластиковых серологические пипетки. Сохранить супернатант в случае процесса центрифугирования была неполной. Осадок затем ресуспендировали мягко либо растирания с P-1000 или быстрого вихря в 300-500 мкл клеточной среде в зависимости от ожидаемой доходности. 10 мкл клеточной суспензии удаляется и помещен на hemacytometer для определения концентрации клеток. Если доходность низка, анализировать супернатант под микроскопом, чтобы определить, центрифугирования шаг был неполным. Повторите центрифугирования может быть необходимым. Если доходность высока, то разбавления может быть необходимо для более точного подсчета. Плотность покрытия сотовых может варьироваться от 5000 до 300000 клеток на МПС. Рассчитать разведения, так что необходимое количество клеток для покрытия находится в конечном объеме 15-20 мкл. Обычно мы используем конечной концентрации от 1000 до 3000 клеток в мкл. Одна пара коры, как правило, доходность от 10 до 15 миллионов клеток. Это число может быть немного ниже, если растирания используется.
15. К этому времени, тон ламинин инкубации на МЭС должна быть полной. Крышка тефлоновым удаляется из МЭС и самое большое падение цен ламинин вакуумной атмосферный или пипеткой прочь. Затем 15-20 мкл клеточной суспензии желаемое немедленно пипеткой на остаточную влажная зона ламинина. Будьте осторожны, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в этот небольшой объем клеточной суспензии, как пузырьки воздуха может предотвратить клетки равномерно охватывающих все электроды. Крышка мягко заменены и МЭС осторожно помещают обратно в инкубаторе в течение 30 минут. Блюдо затем осмотрела под световым микроскопом, чтобы клетки присоединились и охватывать все электроды. Если все электроды не хочет покрываться, то больше клеток могут быть добавлены и МЭС помещается обратно в инкубатор с крышкой, чтобы эти новые клетки придерживаться. Если трубка клеточной суспензии используется более чем на несколько минут просидев спокойно, не забудьте мягко закружить для ресуспендирования поселились клеток. После адекватного охвата электрода достигается, то блюдо медленно залита 1 мл теплой (35-37 ° С) клеточной среде. Крышка Тефлон заменены и блюдо находится еще в инкубаторе. Ламинарном потоке может быстро сохнут небольших объемах ламинин и объемы клеточной суспензии один раз на MEA поэтому позаботьтесь, чтобы они запечатаны с крышками тефлона. Идеальная среда инкубатор для запечатанных МПС составляет 5% СО _2, 9% O ₂ и 65% влажности при температуре 35-37 ° С. Низкое напряжение кислорода является важным для долгосрочного культур, снижения окислительного повреждения. ¹² Сохранение 65% влажности уменьшает испарение через мембрану тефлон (по сравнению с отсутствием контроля влажности) и позволяет МЭС электроники, которые будут использоваться в инкубаторе без повреждения от конденсации воды (как с нормальной инкубатор увлажненный до насыщения).

Г. Изменение клеточной среде и забота о диссоциированных культур на МПС

1. На следующий день после ячейки покрытия, проверить МЭС под световым микроскопом. Если цвет среда еще персик в красный цвет, и есть ограниченное количество продуктов распада клеток и гибель клеток, то первое изменение среды может быть отложено на другой день. Однако, если среда начинают появляться больше оранжевого или желтого цвета и / или есть большое количество продуктов распада клеток и гибель клеток, а затем изменить среду. Все средний изменения должны произойти в стандартном капот культуре клеток ламинарного потока.
2. Первое изменение среда состоит из удаления крышки MEA, аспирационных прочь все среды, в блюдо, заменив сумму удалены свежей средой клетки, а затем заменить крышку. Замените весь объем ячейки среды на первое изменение среды для удаления остатков сотовых мусор с покрытием процесса. Последующие среды изменяется только аспирата от примерно половины среды следует заменить суммы удалены свежей средой. Это позволяет некоторым из факторов роста, которые были секретируется в клеточной среде остаться с клетками поддержания более оптимальный растущей среде. Если нижняя крышка загрязненных течение среднесрочного изменяющийся процесс, или если крышка показывает признаков повреждения или свободной одежде, а затем использовать новые автоклавного крышкой. Сотовые среда может храниться в инкубаторе в стерильный контейнер с крышкой пользовательские изменения (что тефлон (фторированный этилен-пропилен) мембраны, чтобы обеспечить газовый обмен). Сотовые среда может также храниться при температуре 4 ° С, но теплый и равновесие это в инкубаторе до изменения среды.
3. Снять и заменить около половины среды в блюдо примерно в два раза в неделю. Некоторые клеточных препаратов может привести к более быстрому цвет меняется в среднесрочной вызывая потребность в более частых изменений. Если среда отметил быть желтым, а затем изменить всю сумму среды. Быстрый переход к желтому также может быть признаком загрязнения так проверять блюдо под световым микроскопом для визуальных признаков инфекции.
4. В зависимости от условий эксперимента и стерильной техники, культуры, которые были тщательно заботились могут выживать в течение более чем года ^1.

Е. Запись с МПС

1. Каждый МЭС имеет 59 записи электроды и один внутренний электрод землю. Есть несколько коммерческих систем записи доступны, а также на заказ версий. Продавцы включают многоканальных систем, Такер Дэвис технологий, Аксион Biosystems, Альфа-Мед Научно MED64, Plexon, Ayanda биосистем и биологических. Наша лаборатория в настоящее время использует коммерческие установки из многоканальных систем, специально созданных для Windows система называется NeuroRighter ^15, и специально разработанные Linux система называется MeaBench ^16. Каждая из этих систем имеет возможность записи с МПС (многоканальных систем) с помощью многоканальной системы предусилителя. Коммерческие установки из Tucker Дэвис технологии также используются. Этот протокол будет продемонстрировать записи с МПС с NeuroRighter. NeuroRighter программное обеспечение с открытым исходным кодом и доступна для свободного скачивания, а также аппаратных дизайнов на NeuroRighter групп Google. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Культуры на МПС занять 2-3 недели для достижения устойчивого состояния активности. ^17,18 Эта деятельность включает в себя спонтанные потенциалы действия и культуры всей разрыва (шквал потенциалов действия, который распространяется по всему синаптически культуры). Характер эксперимента однако будет определять идеальное количество дней в пробирке перед записью.
3. Нейронной активности зависит от идеальных условий окружающей среды, включая температуру и рН. ^{1 В} результате, наши записи происходит в инкубаторе, как описано выше. Если коротко экспериментов (<30 минут) предназначены, есть также имеющиеся в продаже отопления модуль, который может быть подключен к предусилитель MCS для поддержания идеальной температуры МПС.
4. Чтобы начать запись, МЭА (еще в чашке Петри) аккуратно перенесены из инкубатора для хранения записи инкубатора. Держите дно тарелки параллельно земле. Избегайте резких движений с МЭА или сотрясение МЭА, поскольку они могут отделить культуру от подложки. МЭС затем удаляется из чашки Петри и помещают в записи предусилителя. Матч внутреннего электрода в землю блюд мы в настоящее время демонстрируют с боковой электрод на предусилитель (канал CR15 для предусилителя MCS). Протрите контакты по всему периметру МЭС использованием ткани или ватным тампоном, смоченным 70% этанолом для удаления отпечатков пальцев или других загрязнений, которые могут помешать хорошей связи. Убедившись, что МЭС правильно сидеть, предусилитель крышка опускаются на защелку на место. Контакты на предусилитель крышка должна лежать твердо на электрод контактных площадок на МПС. Осмотрите контакты выравнивание и регулировку с помощью ватного тампона, если это необходимо. Место предусилитель на устройство Пельтье в инкубаторе. Он состоит из двух медных пластин с тепло Пельтье термоэлектрические насос зажатой между ними. Мы проводим это около 5В, чтобы удалить часть тепла от предусилителя схемы. Это предотвращает образование конденсата на внутренней стороне крышки мембраны тефлона. Любой конденсации будет означать ущерб культуре увеличением осмолярности среды в контакт с клетками, за счет испарения. Гарантируя, что предусилитель и среды градус или два ниже температуры воздуха инкубатора, изменения осмолярности сведены к минимуму.
5. Включите питание NeuroRighter и открытого программного обеспечения на рабочей станции. Отрегулируйте NeuroRighter настройки в пробирке с соответствующими конфигурациями программного обеспечения / аппаратных средств также на месте. Выберите количество электродов в программном обеспечении. В целях сокращения количества фонового шума, цифровой полосовой фильтр может быть включен. Выберите файл данных с записью включить, если данные должны быть сохранены для последующего анализа. Активировать кнопку запуска, как только все соответствующие настройки избранных.
6. Экран должен показать работающий следы деятельности и фоновых шумов. Иногда потенциалов действия и широкое блюдо всплесками активности должны быть видны. Ниже раздел по устранению неполадок записи с МПС обсудят ряд общих вопросов, если ожидается активность не визуализируется.
7. Экран может быть изменен на шип режим обнаружения (на вкладке "Spk осциллограмм '), где потенциалы действия отображаются статически, как они происходят в окнах 3 мс время. Для данного канала, реальные внеклеточные потенциалы действия должен длиться примерно 1 мс и должны огнем повторно в том же направлении (положительный или отрицательный). Иногда две или больше нейронов могут быть видны на одном электроде с различной полярностью. Шипы с коротким ходом времени и переменной полярности, скорее всего артефакт. На рисунке 1 показан сюжет растровых данных шип.
8. Экран может быть изменен на локальных потенциалов поля (LFPs) для локализации взглянуть на происхождение разрыва деятельности. Этот тип установки может быть более полезным при съемке в естественных условиях с монослоя культуры имеют слабое LFPs. Следует отметить, что некоторые предварительные усилители (в том числе мы используем из многоканальных систем) имеют высокую фильтров при 10 Гц, что будет ослаблять нижних частот ритмов LFP.

Ф. Стимулирование нейронных сетей на МПС

1. Же 59 записи электродов на МЭА также могут быть использованы для стимулирования культуры. Характер эксперимента будет определять степень стимуляции. NeuroRighter обеспечивает гибкость для стимуляции опытно-конструкторских так как открытый исходный код ^15.
2. Проблема со стимулированием культуры является то, что создает стимул артефакт, который может длиться несколько миллисекунд. Этот артефакт может быть достаточно большим, чтобы вызвать спайк обнаружения и неясные ответы стимул. NeuroRighteГ использует алгоритм Салпа сведения к минимуму и в некоторых случаях существенно устранение стимула артефакт ^19.
3. Чтобы стимулировать нейронные сети MEA, поезд алгоритма Салпа на вкладке "Параметры записи по ограничению стимуляции артефакт. Активировать Салпа на вкладке "Настройки Интернет". Выберите имя файла и нажмите кнопку Пуск, как ранее, чтобы начать запись. Затем нажмите на "Стим" вкладки. Есть много вариантов для создания стимуляции на этой странице.
4. Простой эксперимент заключается в стимулировании одного электрода и наблюдать реакцию блюдо используя раздел "Открыть петля". Выберите скорость, напряжение, ширина фазы и номер канала. Нажмите кнопку Старт в открытом разделе цикла. Ответы на этот стимуляции могут быть визуализированы на основной "Шипы" на вкладке и на вкладке "Spk осциллограмм и проанализированы в файлы данных.
5. В режиме реального времени, вспышки могут быть визуализированы в момент синхронизации образом, чтобы один герц стимулом 0,5 несколькими электродами. На рисунке 2 показан растровых участок после стимул ответ. До наблюдения показали, что Существуют два различных типа стимул-вызванной активности. Непосредственно вызванных потенциалов действия (DAPS) и синаптически вызвала потенциалов действия (СПД) ²⁰
6. Нейроны в культуре есть спонтанные всплески активности. Для некоторых экспериментов, этот тип разрыва может помешать попытке контролировать сеть динамики. Интересно, распределенных стимуляции на уровне 1-2 Гц на электрод может начать подавлять взрыв активности в нейронной сети по МЭС ^21.

Г. Устранение неисправностей записи из МЭС

1. Нет потенциалов действия или разрыва присутствует в МЭС, когда программное обеспечение включено:
   1. Является ли культура достаточно взрослый? Потенциалы действия должны быть видны к концу первой недели в пробирке. Ворвавшись происходит вокруг двух-трех недель в пробирке.
   2. Это аппаратное получает питание? NeuroRighter система использует два 6 В свинцово-кислотных батарей для питания оборудования. Выключатель питания должно быть в от позиции и аккумуляторы.
   3. Является ли культура жива? Иногда это может быть сложно определить, особенно в плотных и старше культуры, потому что разрастание глиальных клеток. Тем не менее, можно искать здоровые нейроны появляются (блестящие, эллиптической формы тела клетки в фазе микроскопии контраст) и неповрежденным (не фрагментированы) клеточных процессов. Там также может быть проблема с культурой, если есть доказательства для видимого загрязнения или унижающему достоинство быстро среды (становится кислой после всего лишь от 1 до 2 дней между средними изменениями).
   4. Что такое сопротивление электрода? За несколько применений, микро-электродов или изоляции МЭС может привести к снижению. NeuroRighter имеет возможности в области оценки электрода импеданс ^15. Нормальные показания сопротивления в районе 1кГц должен находиться в диапазоне от 10000 до 100000 Ом. Высшее сопротивления предлагаю сломанной приводит или электроды и показания менее 10000 Ом предлагаю вытекающей изоляции.
   5. Является ли предусилитель подключен к аппаратным борту? Предусилитель должны иметь выходной кабель, который подключается к аппаратным борту. Предусилитель также имеет 4 дощечки стимулятор, который также подключиться к основной плате аппаратного и важны для стимуляции только.
   6. У NeuroRighter настройки программного обеспечения был изменен? Аппаратная конфигурация параметров в программное обеспечение должно быть правильным для записи на работу. Установка обновленных версий и нескольких пользователей изменении настроек может привести к этому.
   7. Является МЭС при 35-37 ° С? Кулер температуры могут привести к снижению спонтанной активности в корковых сетей. Обычно это не вопрос, поскольку запись происходит в течение климат-контроля инкубатора, однако необходимо учитывать температуру равновесия, если MEA была вне инкубатора для более чем на несколько секунд.
   8. Имеет среда изменилась за последние несколько часов? Мы наблюдали культур часто прекратить стрельбу в течение нескольких часов после кормления. Поэтому, лучше всего проводить эксперименты перед кормлением.
2. Электрод с чрезмерным насыщением фоновый шум окне записи:
   1. Есть контакт предусилитель булавку с электрода на MEA достаточно? Эта проблема может быть вызвана разрегулированные штифт на предусилитель крышкой, небольшой кусок мусора, каплю среды, деградированных поверхности электрода, или перекрытия ясно мембрану из крышки. Проверка контактов на эти вопросы, это первый шаг. Регулировка булавку с ватным тампоном, пропитанным 70% этанола иногда позволяет улучшить контакт, особенно если там была капля среда, которая необходима чистка прочь. Сигнал может показаться хуже, пока этанола испаряется. </ LI>
   2. Имеет ли электрод-видимому, поврежден? Визуализация под световым микроскопом иногда может выявить трещины или без косточек электрод изоляция приводит к такого рода артефакт.
   3. Являются ли носить контактные площадки или поцарапан? Иногда их может быть несколько контактов электрода на МЭС, которые трудно оптимизировать. Это чаще встречается после многократного использования МПС и посевов. Золотой проволоки пропитанной резиновой Spacer проводит только в направлении его толщина 0,5 мм и может улучшить предусилитель контактный контакт с МПС. Этот материал доступен из Fujipoly и может быть симпатичным, чтобы соответствовать МЭС и крышкой.
3. Целые МЭА показывает, чрезмерный шум фона:
   1. Является МЭС в правильной ориентации с тем чтобы боковой электрод на MEA связаться с заземлением на предусилитель? Если МЭС находится в правильной ориентации, то обеспечение Есть нет контакта с землей вопросов (2 переменного тока выше), также важно, чтобы рассмотреть. Является ли канал CR15 обоснованным с коротким проводом для предусилителя шасси? Использование перемычек на землю через внутренний резистор 30 кОм может привести избыток шума.
   2. Есть ли помехи от окружающего света, источников питания или других единиц оборудования? Одним из наиболее распространенных форм вмешательства составляет 60 Гц от света и оборудования. Система регистрации должна быть правильно заземлены. Экранирование кабелей подвергается также может быть полезно на снижение фоновых помех.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Это растровых участок 2 минуты спонтанной активности нейронов сети. Каждая черная точка представляет потенциала действия. Две вспышки активности, отмечены синими стрелками. Ответ в течение нескольких электродов является функцией подключения к сети.

Рисунок 2. Вот растровых участок 16 секунд стимул-вызванной активности. Красные звезды представляют собой стимулы. Красные стрелки показывают пять стимулов, которые успешно индуцированных всплески синаптической активности на несколько электродов. Иногда стимулом не дает взрыв, здесь, в синей стрелкой.

Discussion

Этот протокол показывает, инструкции по культуре и поддерживать нейронных сетей на микро-электрод массивов, а также введение в записи с и стимулирования нейронных сетей. Некоторые из наиболее распространенных проблем при записи с МПС были также обсуждены в разделе МЭС устранения неисправностей. Есть случайные вариации протокола о чем говорилось во всем и часто эти изменения используются для оптимизации конкретных условий, требуемых некоторые экспериментальные проекты.

Хотя запись и стимулирование системы, представленные здесь состоит из наших специально созданных NeuroRighter ¹⁵ с предусилителем MCS, Есть несколько других систем, которые могут обеспечить интерфейс с нейронных сетей. Выбор конкретной установки будет зависеть от конкретных экспериментальных потребностей.

Упрощенные записи и стимуляции примеры были предоставлены в данном протоколе, однако эти культуры на МПС могут быть использованы для обеспечения понимания сложных вопросов о синаптической активности нейронов и подключения к сети. Как упоминалось выше, текущая работа является использование этой технологии для изучения процессов, таких как сотовые пластичность, развитие, эксайтотоксичность и нейродегенерации. ^6-10 Например, недавняя публикация в нашей лаборатории показали, воспроизводимые целенаправленного обучения в пробирке в режиме реального времени закрыты стимуляции цикла в ответ на текущую активность нейронов сети ^3.

Хотя МЭС культур часто привередливы и нежный, благодаря своей простоте и доступности (по сравнению с интактными животными), они обеспечивают мощную модель для изучения нейронной активности на сетевом уровне.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.