Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

Summary

Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs.

Abstract

Für die letzten Jahrhunderts haben viele Neurowissenschaftler auf der ganzen Welt ihr Leben zu verstehen, wie neuronale Netzwerke gewidmet und warum sie stoppen bei verschiedenen Krankheiten arbeiten. Studien haben neuropathologischen Beobachtung, Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen Kennzeichnung und intrazelluläre Aufnahme in beiden dissoziierten Neuronen und in Scheiben schneiden Vorbereitungen einbezogen. Dieses Protokoll beschreibt eine andere Technologie, die wachsende dissoziierten neuronalen Kulturen auf Micro-Elektroden Arrays (auch als Multi-Elektroden-Arrays, MEAs) beinhaltet.

Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung dieses Systems gegenüber anderen Technologien. Dissoziierten neuronalen Kulturen auf MEAs bieten ein vereinfachtes Modell, in dem Netzwerk-Aktivität mit elektrischer Stimulation Sequenzen durch die Arrays mehrere Elektroden manipuliert werden können. Da das Netzwerk klein ist, ist die Wirkung der Stimulation auf beobachtbare Bereiche, die nicht der Fall ist in der intakten Präparate begrenzt. Die Zellen wachsen in einer Monoschicht Änderungen in der Morphologie leicht mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu überwachen. Schließlich können Kulturen auf MEAs über ein Jahr lang in vitro, die eine klare zeitliche Beschränkungen, die mit anderen Kultivierungsmethoden entfernt überleben. ¹

Unser Labor und andere rund um den Globus nutzen diese Technologie, um wichtige Fragen zu neuronalen Netzen zu fragen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs bieten. In-vitro-Netzwerke bieten eine Möglichkeit für Fragen physiologisch relevanten Fragen bei der Netzwerk-und zellulärer Ebene, was zu einem besseren Verständnis der Gehirn Funktion und Dysfunktion.

Protocol

A. Einführung

Es gibt Milliarden von Neuronen im menschlichen Gehirn. Jedes dieser Neuronen können hunderte bis tausende von Verbindungen oftmals mit vielen verschiedenen Zellen. Diese Verbindungen Hafen die Signale, die uns zu gehen, spielen Klavier, Fahrrad fahren, lachen, weinen und erinnern lassen. Für die letzten Jahrhunderts haben viele Neurowissenschaftler auf der ganzen Welt ihr Leben zu verstehen, wie neuronale Netzwerke gewidmet und warum sie stoppen bei verschiedenen Krankheiten arbeiten.

Es gibt viele Tools, die man verwenden, wenn auf diese scheinbar unlösbare Aufgabe können. Erste Untersuchungen wurden am neuropathologischen Beobachtung, wie neuronale Schaltkreise im Gehirn von Menschen und anderen Tieren organisiert konzentriert. Das Aufkommen der Fluoreszenzmikroskopie und genetische Markierung erweitert den Anwendungsbereich dieser strukturellen Untersuchungen zu zellulären Zusammensetzung bis auf die Protein-und DNA-Ebene.

Aber diese Versuche haben nicht die dynamische Funktion des Gehirns, nur die statische Anordnung. Für das Verständnis laufenden neuronalen Aktivität, populäre Techniken, die allgemein auf die Prüfung elektrophysiologische Aktivität mit intrazellulären Aufnahme konzentrieren. Einzelne Neurone dissoziierter Kulturen stellen einen nützlichen reduktionistischen Modell, aber diese Technik wird durch kurze Zeitintervalle für die Aufnahme von einzelnen Zellen begrenzt. Dieses Modell bietet auch nur begrenzte Informationen über die anderen Zellen im Netzwerk. Hirnschnitten von Nagetieren bieten mehr von einer realistischen Modell, bei dem kortikalen Architektur erhalten bleibt. Aber solche Scheiben, auch wenn kultiviert, haben eine begrenzte Lebensdauer und kann technisch schwierig sein, am Leben zu erhalten unter Beibehaltung Zytoarchitektur ^2.

Eine andere Technologie beinhaltet wachsenden dissoziierten neuronalen Kulturen auf Mikro-Elektroden-Arrays (auch als Multi-Elektroden-Arrays, MEA). Neuronen sind auf MEAs, die Mikroelektroden in den Boden der Schale eingebettet haben vernickelt. Im Laufe der drei Wochen, bilden diese Kulturen Netzwerken von Neuronen komplett mit Axonen, Dendriten und Hunderte wenn nicht Tausende von synaptischen Verbindungen. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung dieses Systems gegenüber anderen Technologien. Dissoziierten neuronalen Kulturen auf MEAs bieten ein vereinfachtes Modell, mit dem gearbeitet (in der Größenordnung von einem kortikalen Säule statt eines intakten Gehirn). Die Zellen wachsen in einer Monoschicht Änderungen in der Morphologie leicht mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu überwachen. Netzwerk-Aktivität kann mit elektrischer Stimulation Sequenzen durch die Arrays mehrere Elektroden manipuliert werden. Da das Netzwerk klein ist, ist die Wirkung der Stimulation auf beobachtbare Bereiche, die nicht der Fall ist in der intakten Präparate begrenzt. Schließlich Kulturen auf MEAs kann über ein Jahr lang in vitro, die eine klare zeitliche Beschränkungen, die mit anderen Kultivierungsmethoden entfernt überleben. ¹ Darum stellen Kulturen auf MEAs ein ideales Modell für die Untersuchung neuronaler Konnektivität.

Unser Labor und andere rund um den Globus nutzen diese Technologie, um wichtige Fragen zu neuronalen Netzen zu fragen. Aktuelle neuronalen Prozesse, die mit diesem Modell untersucht zählen Netzwerk-Dynamik, Entwicklung, Lernen und Gedächtnis, synaptische Plastizität, Exzitotoxizität, Ischämie und Neurodegeneration. ^3-10 Erkenntnisse aus diesen Studien konnten signifikante Auswirkungen auf den Aufbau besserer Therapien für menschliche Krankheiten wie angeborene Fehlbildungen, Epilepsie haben , Schlaganfall und Alzheimer. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und anregende Kulturen auf MEAs bieten. Das ultimative Ziel ist es, ein Mittel bereitzustellen, für Forscher, physiologisch relevanten Fragen auf zellulärer und Netzebenen, die vielleicht zu einem besseren Verständnis der Hirnfunktion und Dysfunktion und schließlich die Behandlung von Krankheiten, die unsere Neuronen und wie sie kommunizieren, beeinflussen können, führen zu bitten.

Das folgende Protokoll stellt mehr als 10 Jahre Erfahrung aus unserem Labor in der Kultivierung der Aufnahme von und anregende neuronale Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays. Jeder Schritt wurde so zur Entwicklung der lange überleben gesunde neuronale Netze führen zu optimieren. Referenzen sind vorhanden, wo verfügbar, während einige optimalen Einstellungen, die wir empirisch ermittelt. Vor Beginn des Protokolls, erhalten Ausrüstungen und Zubehör und bereiten Lösungen wie in dem Abschnitt aufgeführt "Materialien". Der Abschnitt über 'Brain Dissection' wird kurz besprochen werden, aber nicht im zugehörigen Video als andere Journal of Visualisierte Experiment Artikel decken das Thema ¹¹ gezeigt.

B. Gehirn Dissection

1. Ganze Gehirne von embryonalen Tag 18 (E18) Ratten gewonnen. Timed-schwangeren weiblichen Ratten werden anästhesiert mit inhalativen Isofluran und enthauptet. Embryonen entnommen und nach dem National Research Council der Guid sezierte für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren mit einem Protokoll, das von der Emory University IACUC genehmigt.
2. Unter Ausnutzung aseptischen Bedingungen sind die embryonalen Gehirne entnommen und in Balanced Salts kalten Hank-Lösung (HBSS) in einem 100 mm sterile Petrischale. Der Rest der Dissektion Protokoll tritt unter einem Binokular in einer Sterilbank, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
3. Das Gehirn von Ratten sind ein zu einer Zeit auf eine zweite sterile Petrischale überführt mit HBSS für die Präparation. Während in HBSS untergetaucht, sind der Hirnstamm, Thalamus und Kleinhirn weggeschnitten und die Hemisphären sind zweigeteilt.
4. Die Riechtuberkel wird als Handle für die Sicherung der Hemisphäre unter leichtem Entfernen der Hirnhäute genutzt.
5. Die Rinde wird dann vom zugrunde liegenden Hippocampus und Striatum geschält und in einem sterilen 15 ml konischen Rohr in den Ruhezustand Lösung auf Eis. ¹² Da es in der Regel mehrere Embryonen sind, ist dieses Verfahren dann wiederholt in Abhängigkeit von der gewünschten Anzahl von MEAs werden vergoldet und die gewünschte Zelldichte. Rinden sind für die Zelle Dissoziation Prozess kombiniert wie unten diskutiert. Rinden kann bei 4 ° C gelagert werden in den Ruhezustand Lösung für bis zu 24 Stunden vor der Dissoziation mit nur minimalem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen. Als Alternative zur Verwendung von Gewebe in-house seziert, können seziert Hirngewebe Kauf von Brain Bits (werden www.brainbitsllc.com ).

C. MEA Vorbereitung und kortikalen Dissoziation

1. Die MEAs sind von ALA Scientific (erhalten www.alascience.com ), ein Anbieter für die Hersteller, Multi-Channel-Systeme. Es gibt verschiedene Konfigurationen, um die MEAs mit Variationen in Elektrode Orientierung und den Abstand, der Anwesenheit oder Abwesenheit eines internen Masseelektrode, Vorhandensein oder Fehlen von einem Glasring, und die Größe des Glases Ring. Für unsere grundlegenden Experimenten verwenden wir die Standard-Mikro-Elektroden-Array mit 60 Elektroden in einem 8 x 8 Gitter Anordnung mit einem kleinen Glas Ring. Die Titan-Nitrid-Elektroden-Durchmesser beträgt 30 pm und der Abstand zwischen Elektrode Zentren ist 200 um. Eine der Elektroden ist größer und Funktionen wie die Erde oder interne Referenz-Elektrode. Beim Umgang mit MEAs, ist es äußerst wichtig, dass keine festen Gegenstände (zB Pipettenspitzen, Papiertaschentücher oder Gummi Polizisten) je berühren die Innenseite der Schale, da die Elektroden beschädigen können. Detailliertere Informationen über MEAs und Handhabung finden Sie in der MEA Bedienungsanleitung (gefunden werden www.multichannelsystems.com / products-mea / Mikroelektroden-arrays.html ).
2. Am Abend vor der Zelle Herstellung werden die MEAs mit entionisiertem Wasser gespült und dann ließ man in 70% Ethanol für 15 Minuten einweichen. Die Gerichte werden dann in einer Sterilbank mit dem UV-Licht über Nacht gelegt. Für den Umgang Zwecke wird jeder MEA in einem Standard 100 mm sterile Polystyrol-Petrischale mit Datum und Kennzeichnung auf der Petrischale platziert. Zu beachten ist, andere Sterilisations-Techniken, einschließlich Autoklavieren und Nutzung von Wasser bei 90 ° C sind in der MEA Bedienungsanleitung erwähnt. Allerdings haben wir empirisch festgestellt, dass Autoklavieren auf die Anzahl der Male, dass ein MEA verwendet werden können Rückgang scheint. Wenn Sie die Wiederverwendung von MEAs, die derzeit Kulturen sind, dann ist die organische Substanz entfernt werden muss. 300-400 ul von 0,25% Trypsin in PBS wird auf der MEA bei 35-37 ° C für 20 Minuten inkubiert. Die MEA ist mit entionisiertem Wasser gespült und anschließend mit einem Lichtmikroskop untersucht. Wenn zelluläre Sache bleibt, dann ist die Trypsin Schritt ist, bis sie sauber wiederholt. Wenn die Schüssel sauber ist, dann mit der Sterilisation Schritt wie oben beschrieben. Im Allgemeinen können MEAs mehrfach mit der gebotenen Sorgfalt verwendet werden.
3. Auch am Abend vor dem Beschichten werden die MEA Deckel vorbereitet und autoklaviert. Die Deckel sind maßgeschneiderte, kann aber auch von ALA-Scientific erworben werden. Sie sind aus Polytetrafluorethylen Teflon gefertigt und haben eine klare Membran (fluorierte Ethylen-Propylen-Teflon) erstreckte sich über die Spitze. Die Membran ermöglicht die Diffusion von Gasen, sondern begrenzt die Diffusion von Wasser dadurch nahezu eliminiert die Notwendigkeit für eine feuchte Atmosphäre und dadurch die schädliche Wirkung von Verdunstung und Hyperosmolarität. ¹
4. Nach der Präparation oben abgeschlossen ist, MEA Vorbereitung, indem 100 ul von Polyethylenimin (PEI)-Lösung in der Mitte jedes MEA wird fortgesetzt. ¹³ In unseren Händen, bietet PEI-Lösung weniger Clustering von Zellen in der MEA als die Verwendung von Polylysin. Das Gericht darf bei Raumtemperatur in der Laminarströmungshaube sitzen für 30 Minuten mit Deckel leicht ruht auf der MEAs, um Verdunstung zu verhindern. Zur Erinnerung, sollten jegliche Arbeit mit dem offenen MEA oder Hirngewebe in einem Standard-Zellkultur Laminarströmungshaube zu ergreifen, um minimieren das Risiko einer Kontamination.
5. Die MEA ist dann 3 mal mit 1-2 ml sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die ideale Laminarströmungshaube Set-up wird auch eine Absaugvorrichtung Vorrichtung zum Entfernen von Flüssigkeit aus Speisen. Eine sterile 200 ul Pipettenspitze kann der Sauger Schläuche angeschlossen werden. Berühren Sie nicht die Oberfläche der MEA während Absaugen, da die Elektroden beschädigen können. Nach der letzten Spülung wird die MEA dürfen für mindestens 30 Minuten in der Sterilbank trocknen.
6. Während dieser Trocknungszeit wird das neuronale Dissoziation, indem Sie den Kortex in 2 ml Papain-Lösung in einem 15 ml sterile konische Kunststoff-Fläschchen gestartet. ¹ 50 ul DNAse zu der Mischung hinzugefügt. Das Fläschchen ist in ein Wasserbad bei 35-37 ° C gebracht und inkubiert für ca. 20 Minuten. Klopfen Sie leicht die Lösung alle 5 Minuten für das Mischen und achten zu vermeiden Einführung von Blasen. Der Kortex sollten anfangen, über eine Fuzzy-Auftritt als die Verdauung Erlös zu nehmen.
7. Das Papain-Lösung wird dann sorgfältig durch Pipettieren Verlassen des Kortex in der 15 ml konische Röhrchen entfernt. 2 ml Zellmedium ist es, die Kortex aufgenommen, dürfen für 2-3 Minuten inkubieren und dann vorsichtig entfernt werden. Dies ist zum Auswaschen restliche Papain, die auch durch das Serum in das Medium gehemmt werden. Ein weiterer 2 ml Zellmedium ist es, die Kortex aufgenommen und dieser Probe wird dann bei hoher Geschwindigkeit für 5-10 Sekunden gevortext. Es sollte eine trübe Lösung in den Boden des 15 ml konische Röhrchen und keine verbleibende Gehirn Stücke sein. Alternativ mit Verreiben mit 1 ml Medium mit 3 mal P-1000 Handpipette kann für die Dissoziation des Gewebes verwendet werden. ¹ Für richtige Verreibung, jede Pipette Schlaganfall sollte 1 Sekunde dauern.
8. Die Lösung ist dann erlaubt, sanft durchlaufen eine sterile 40 um Zellsieb über die Schwerkraft. Langsam fügen Sie die Zell-Lösung einen Tropfen zu einem Zeitpunkt, in dem Sieb mit einer P-1000. Ein 35 mm sterilen Petrischale wird zur Sammlung der angespannten Zell-Lösung genutzt werden.
9. Die Zellsuspension wird dann wieder in ein konisches 15 ml Fläschchen übertragen und Zellmedium wird auf ein Endvolumen von 4,0 ml hinzugefügt. ¹⁴
10. 500 ul einer 5% w / v BSA-Lösung wird dann vorsichtig in den Boden des 15 ml konische Röhrchen mit einem P-1000 geschichtet. ¹⁴ Dadurch wird die Zelle enthaltenden Lösung nach oben in die Flasche zu verdrängen.
11. Die Zell-Lösung mit BSA geschichtet in den Boden wird dann für 6 Minuten bei 200 xg zentrifugiert, um kleine Fremdkörper und potentiell toxischen intrazellulären Inhalte zu entfernen. ¹⁴
12. Während die Zelle Zentrifugationsschritt werden die MEAs visuell beurteilt, um sicherzustellen, dass sie vollständig trocken sind. 20 ul Laminin-Lösung werden dann vorsichtig in die Mitte des MEA gelegt sicherzustellen, dass alle von den Elektroden bedeckt sind. ¹ Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen in diese Lösung, da die unzureichende Vorbereitung der Elektrodenoberfläche führen kann. Wenn der MEA nicht vollständig trocken ist, dann ist die Drop von Laminin wird über den Teller verteilen möglicherweise macht es immer schwieriger, angemessen zu lokalisieren die Zellen über die Elektroden beim Plattieren. Dieser Schritt ist sehr zart und hat das Potenzial, um MEA Beschädigung der Oberfläche mit unsicherer Hand führen oder Erlöschen der Aufmerksamkeit.
13. Der Teflon-Deckel sind auf die MEA an dieser Stelle platziert, um die Verdampfung des Laminin zu verhindern. Die Platzierung des Deckel ist ebenfalls heikel. Ein Deckel sollte nur gestellt oder entfernt werden, wenn die MEA basiert auf einem völlig ebenen Fläche. Andernfalls kann zusätzliche Kräfte, die durch eine unebene Oberfläche ausgeübt knacken Sie den Glasboden des Arrays macht sie unbrauchbar. Das Gericht wird dann in den Brutschrank für 20 Minuten gelegt.
14. Während die Laminin ist die Bindung an das Gericht, ist die 15 ml konische Röhrchen mit den Zellen aus der Zentrifuge entnommen und zurück zum Laminarströmungshaube. Ein Pellet sichtbar sein soll in den Boden des Fläschchens. Der Überstand wird vorsichtig mit einer sterilen 5 ml Kunststoff serologischen Pipette entfernt. Speichern Sie die überstehenden bei der Zentrifugation war unvollständig. Das Pellet wird dann vorsichtig entweder durch Verreiben mit einem P-1000 oder einen schnellen Wirbels in 300-500 ul Zellmedium in Abhängigkeit von der erwarteten Rendite resuspendiert. 10 ul der Zellsuspension entnommen und auf einem Hämacytometer zu Zellkonzentration zu bestimmen. Wenn die Ausbeute gering ist, analysieren der Überstand unter dem Mikroskop zu bestimmen, ob die Zentrifugationsschritt war unvollständig. Wiederholen Sie die Zentrifugation notwendig sein. Wenn die Ausbeute hoch ist, dann eine Verdünnung erforderlich sein für eine genauere Zählung. Zell Plattierungsdichte kann von 5.000 bis 300.000 Zellen pro MEA-Bereich. Berechnen einer Verdünnung, so dass die gewünschte Anzahl von Zellen für die Beschichtung in einem Endvolumen von 15-20 ul ist. Wir verwenden in der Regel in einer Endkonzentration von 1000 bis 3000 Zellen pro Mikroliter. Ein Paar Cortex wird in der Regel Rendite zwischen 10 und 15 Millionen Zellen. Diese Zahl kann etwas geringer sein, wenn Verreibung genutzt wird.
15. Zu diesem Zeitpunkt ter Laminin Inkubation auf dem MEA abgeschlossen sein. Die Teflon Deckel ist aus der MEA entfernt und die meisten der Laminin Tropfen Vakuum abgesaugt und pipettiert entfernt. Anschließend 15-20 ul der gewünschten Zellsuspension wird sofort auf die Rest-Nassbereich von Laminin pipettiert. Achten Sie darauf, um zu vermeiden Einführung von Luftblasen in diesem kleinen Volumen Zellsuspension als Luftblasen können Zellen aus gleichmäßig über alle von den Elektroden zu verhindern. Der Deckel ist leicht ersetzt und die MEA ist vorsichtig zurück in den Inkubator für 30 Minuten gelegt. Die Schale wird dann unter dem Lichtmikroskop zu gewährleisten, dass die Zellen eingehalten und alle der Elektroden überprüft. Wenn alle die Elektroden nicht abgedeckt sind, dann weitere Zellen hinzugefügt werden kann und der MEA ist zurück in den Inkubator mit Deckel aufsetzen, damit diese neuen Zellen zu haften. Wenn ein Rohr Zellsuspension mehr als ein paar Minuten nach dem Sitzen ungestört verwendet wird, achten Sie darauf, schwenken Sie nach ständiger Zellen zu resuspendieren zu. Sobald eine angemessene Abdeckung Elektrode erreicht ist, dann die Schale langsam mit 1 ml warmem (35-37 ° C) Zellmedium überflutet. Die Teflon Deckel ersetzt wird und die Schüssel wieder in den Inkubator gestellt. Die Laminar-Flow-Haube kann schnell trocknen die kleinen Laminin Volumina und Zellsuspension Bände einmal auf dem MEA so kümmern, damit sie dicht mit dem Teflon Deckel. Die ideale Inkubator Umgebung für die versiegelten MEA ist 5% CO _2, 9% O ₂ und 65% Luftfeuchte bei 35-37 ° C. Low Sauerstoffspannung ist für die langfristige Kulturen wichtig, der Reduzierung oxidativer Schäden. ¹² Warten 65% Luftfeuchtigkeit verringert die Verdunstung durch die Teflon-Membran (im Vergleich zu keiner Feuchtigkeit) und ermöglicht MEA Elektronik im Inkubator verwendet werden, ohne Schäden durch Kondensation von Wasser (als mit einem normalen Inkubator befeuchtet bis zur Sättigung).

D. Ändern Zellmedium und Pflege von dissoziierten Kulturen auf MEAs

1. Am Tag nach Zell Plattieren, überprüfen Sie die MEA unter dem Lichtmikroskop. Wenn die Farbe des Mediums ist noch Pfirsich, um in der Farbe rot und es gibt eine begrenzte Anzahl von Zelltrümmern und Zelltod, dann das erste Medium verändern kann für einen anderen Tag verschoben werden. Allerdings, wenn das Medium fängt an, erscheinen orange oder gelb in der Farbe und / oder es wird eine große Menge von Zelltrümmern und Zelltod, dann ändern Sie das Medium. Alle mittel-Änderungen sollten in einem Standard-Zellkultur Laminarströmungshaube auftreten.
2. Der erste Mediumwechsel besteht aus dem Entfernen der MEA Deckel, Absaugen entfernt das gesamte Medium in die Schüssel, ersetzen den Betrag mit frischen Zellmedium entfernt und dann wieder den Deckel. Ersetzen Sie den gesamten Betrag des Zellmedium auf dem ersten Medium ändern, um alle verbleibenden Zelltrümmer aus der Beschichtung zu entfernen. Nachfolgende Medium Änderungen sollten nur entfernt absaugen etwa die Hälfte des Mediums durch das Ersetzen der Menge durch frisches Medium entfernt wird. Dies erlaubt einige der Wachstumsfaktoren, die in das Zellmedium wurden abgesondert wird, um mit den Zellen die Aufrechterhaltung einer mehr optimal wachsenden Umfeld bleiben. Wenn die Unterseite des Deckels während des Mediums verändern verunreinigt oder wenn der Deckel zeigt Anzeichen von Schäden oder locker sitzende, dann nutzen eine neue autoklaviert Deckel. Zell-Medium kann in dem Inkubator in einem sterilen Behälter mit einem benutzerdefinierten geändert Deckel (die eine Teflon (fluorierte Ethylen-Propylen)-Membran für Gasaustausch ermöglichen) gespeichert werden. Zell-Medium kann auch bei 4 ° C gelagert werden, aber warm und Gleichgewicht dieser in den Inkubator vor dem Wechsel-Medium.
3. Entfernen und ersetzen etwa die Hälfte des Mediums in einer Schale etwa zweimal die Woche. Einige Zellen Präparate können zu einer schnelleren Farbwechsel in das Medium verursacht eine Notwendigkeit häufiger Veränderungen führen. Wenn Medium wird darauf hingewiesen, gelb zu sein, ändern Sie dann die gesamte Menge des Mediums. Schnelle Umstellung auf gelbe kann auch das Zeichen der Verschmutzung so überprüfen Sie das Gericht unter dem Lichtmikroskop für die visuelle Anzeichen einer Infektion.
4. Je nach Experiment Bedingungen und sterile Technik können Kulturen, die sorgfältig gepflegt für mehr als ein Jahr überleben. ¹

E. Aufnahme von MEAs

1. Jede MEA hat 59 Aufnahme Elektroden und einer internen Masseelektrode. Es gibt mehrere kommerzielle Aufnahme-Systeme zur Verfügung sowie kundenspezifische Ausführungen. Anbieter sind Multi-Channel Systems, Tucker Davis Technologies, Axion Biosystems, Alpha Med Scientific MED64, Plexon, Ayanda Biosystems und BioLogic. Unser Labor verwendet derzeit eine kommerzielle Einrichtung von Multi-Channel Systems, ein kundenspezifisches Windows-basiertes System namens NeuroRighter ^15, und eine speziell entwickelte Linux-basierten System namens MeaBench ^16. Jedes dieser Systeme ist in der Lage, von MEAs (Multi-Channel-Systeme) mit Hilfe einer Multi-Channel Systems Vorverstärker aufzunehmen. Eine kommerzielle Einrichtung von Tucker Davis Technologies ist auch im Einsatz. Dieses Protokoll wird die Aufnahme von MEAs mit NeuroRighter demonstrieren. NeuroRighter Software ist Open-Source und steht zum kostenlosen Download zusammen mit dem Hardware-Designs auf NeuroRighter Google Gruppen. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Kulturen auf MEAs erst nach 2-3 Wochen bis zu einem steady state der Aktivität zu erreichen. ^17,18 Diese Tätigkeit umfasst spontanen Aktionspotentiale und Kultur-weiten Platzen (eine Flut von Aktionspotentialen, die synaptisch erstreckt sich über eine Kultur). Die Natur des Experiments jedoch bestimmt die ideale Anzahl von Tagen in vitro vor der Aufnahme.
3. Neuronale Aktivität ist abhängig von idealen Umgebungsbedingungen wie Temperatur und pH-Wert. ¹ Als Ergebnis nimmt unsere Aufnahme in den Inkubator, wie oben beschrieben. Wenn kurze Experimente (<30 Minuten) ausgelegt sind, gibt es auch ein im Handel erhältliches Heizmodul, dass die MCS-Vorverstärker für die Aufrechterhaltung der ideale MEA Temperatur angeschlossen werden können.
4. Zum Starten der Aufnahme ist ein MEA (noch in den Petrischale) vorsichtig aus dem Storage-Inkubator, um die Aufnahme Inkubator überführt. Halten Sie den Boden der Schale parallel zum Boden. Vermeiden Sie schnelle Bewegungen mit dem MEA oder Erschütterungen des MEA, da diese die Kultur vom Substrat zu lösen. Die MEA wird dann aus der Petrischale entfernt und in die Aufnahme-Vorverstärker. Spiel der internen Masse-Elektrode in die Gerichte, die wir derzeit zeigen, sind mit der Masseelektrode auf der Vorverstärker (Kanal CR15 für den MCS-Vorverstärker). Reinigen Sie die Kontakte rund um den Perimeter der MEA mit einem Gewebe oder einem Wattestäbchen mit 70% Ethanol befeuchtet, um Fingerabdrücke oder andere Verunreinigungen, die eine gute Verbindung behindern können, zu entfernen. Nachdem er sich vergewissert, dass der MEA richtig sitzt, ist der Vorverstärker Deckel dann abgesenkt und eingerastet. Die Kontakte auf der Vorverstärker Deckel sollte fest ruhen auf der Elektrode Kontaktflächen auf der MEA. Sichtprüfung Kontakt Ausrichtung und Einstellung mit einem Wattestäbchen, wenn nötig. Setzen Sie den Vorverstärker an die Peltier-Vorrichtung in den Inkubator. Diese besteht aus zwei Kupferplatten mit einem Peltier-Wärmepumpe zwischen ihnen eingeklemmt. Wir führen dies auf etwa 5V, um einen Teil der Wärme durch die Vorverstärker-Schaltung erzeugten entfernen. Dies verhindert die Bildung von Kondenswasser an der Innenseite der Teflon-Membran Deckel. Eine Kondensation würde bedeuten, schadet der Kultur durch Erhöhung der Osmolarität des Mediums in Kontakt mit den Zellen, durch Verdunstung. Durch die Sicherstellung der, dass Vorverstärker und dem Medium ein oder zwei Grad unter dem Inkubator Lufttemperatur, werden die Änderungen in der Osmolarität minimiert.
5. Schalten Sie die Stromversorgung NeuroRighter und öffnen Sie die Software auf der Workstation. Passen NeuroRighter Einstellungen in vitro mit entsprechender Software / Hardware-Konfigurationen auch in Platz. Wählen Sie die Anzahl der Elektroden in der Software. Um die Menge Hintergrundgeräusche zu reduzieren, kann ein digitales Band-Pass-Filter aktiviert werden. Wählen Sie eine Datei mit der Plattenfirma einschalten, wenn die Daten für eine spätere Analyse gespeichert werden. Aktivieren Sie die Starttaste, sobald alle erforderlichen Einstellungen gewählt werden.
6. Der Bildschirm sollte show running Spuren von Aktivität und Hintergrundgeräusche. Gelegentliche Aktionspotentiale und Geschirrtücher große Ausbrüche von Aktivität sollten sichtbar sein. Im folgenden Abschnitt zur Fehlerbehebung Aufnahme von MEAs werden dann diverse allgemeine Probleme, wenn zu erwartende Wirkung ist nicht sichtbar.
7. Die Bildschirmansicht kann Spike-Erkennung-Modus ("Spk wfms 'tab), wo Aktionspotentiale statisch angezeigt, wie sie in 3ms Zeitfenstern auftreten geändert werden. Für einen bestimmten Kanal dürfte das reale extrazellulären Aktionspotentiale dauern ca. 1 ms und sollte wiederholt Feuer in der gleichen Richtung (positiv oder negativ). Gelegentlich können auch zwei oder mehr Neuronen sichtbar auf der gleichen Elektrode mit unterschiedlicher Polarität. Spikes mit einer kurzen zeitlichen Verlauf und die variable Polarität wahrscheinlich Artefakt. Abbildung 1 zeigt ein Raster Grundstück von Spike Daten.
8. Die Bildschirmansicht kann es zu lokalen Feldpotentiale (LFPs) für einen Blick auf die Lokalisierung der Herkunft Platzen Aktivität verändert werden. Diese Art von Einstellung kann nützlicher sein, wenn die Aufnahme in vivo seit Monolayerkulturen schwachen LFPs haben. Zu beachten ist, haben einige Vorverstärker (einschließlich eines verwenden wir von Multi-Channel Systems) Hochpassfilter bei 10 Hz, die niedrigere Frequenz LFP Rhythmen abschwächen wird.

F. Förderung neuronaler Netze auf MEAs

1. Die gleiche Aufnahme 59 Elektroden auf einem MEA kann auch für die Förderung der Kultur genutzt werden. Die Natur des Experiments bestimmen das Ausmaß der Stimulation. NeuroRighter bietet Flexibilität für die Stimulation experimentelles Design, da es Open-Source-Code ist. ¹⁵
2. Die Herausforderung bei Förderung einer Kultur ist, dass der Reiz ein Artefakt, das mehrere Millisekunden dauern kann schafft. Dieses Artefakt kann groß genug sein, um Spike-Erkennung und obskuren Reizantworten auslösen. NeuroRighter nutzt die SALPA Algorithmus zur Minimierung und in einigen Fällen in erster Linie die Beseitigung der Reizartefakt. ¹⁹
3. Zur Stimulierung des neuronalen Netzes auf dem MEA, dem Zug der SALPA Algorithmus im Rahmen der "Aufnahme-Einstellungen ', um die Stimulation Artefakt zu begrenzen. Aktivieren SALPA in der "Online-Einstellungen" klicken. Wählen Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Start wie zuvor der Aufnahme zu beginnen. Dann auf der "Stim-Registerkarte klicken. Es gibt viele Möglichkeiten für die Einrichtung Stimulation auf dieser Seite.
4. Ein einfaches Experiment ist auf eine Elektrode anzuregen und beobachten Sie die Reaktionsfähigkeit der Schale mit dem "Open Loop" Abschnitt. Wählen Sie die Geschwindigkeit, Spannung, Phase und Breite Kanalnummer. Drücken Sie die Start-Taste in der Open-Loop-Bereich. Antworten auf diese Stimulation kann visualisiert werden auf der Hauptseite "Spikes" und die Registerkarte "Spk wfms 'Tab und analysiert die Daten-Dateien.
5. In Echtzeit können Bursts werden in einer Zeit-locked Weise zu einem ein Hertz Stimulus von 0,5 V über mehrere Elektroden visualisiert. Abbildung 2 zeigt ein Raster Handlung eines post-Stimulus-Antwort. Vor Beobachtungen haben gezeigt, dass es zwei verschiedene Arten von Stimulus-evozierte Aktivität:. Unmittelbar hervorgerufenen Aktionspotentiale (DAPS) und synaptisch evozierter Aktionspotentiale (SAPS) ²⁰
6. Neurone in Kultur spontane Ausbrüche von Aktivität. Für einige Experimente, kann diese Art von Platzen mit dem Versuch, das Netzwerk Fahrdynamikregelung stören. Interessanterweise kann verteilt Stimulation bei 1-2 Hz pro Elektrode beginnen zu unterdrücken Platzen Tätigkeit in einem Neuronalen Netzes auf einem MEA. ²¹

G. Fehlersuche Aufnahme von MEAs

1. Keine Aktionspotentiale oder Bersten in der MEA, wenn die Software aktiviert ist:
   1. Ist die Kultur alt genug? Aktionspotenziale sichtbar sein soll gegen Ende der ersten Woche in vitro. Bersten rund zwei vor drei Wochen in vitro.
   2. Ist die Hardware mit Strom versorgt? Die NeuroRighter System nutzt zwei 6V Blei-Säure-Batterien für die Hardware. Der Netzschalter muss sich in der Stellung und die Batterien aufgeladen werden.
   3. Ist die Kultur am Leben? Manchmal kann eine Herausforderung sein, vor allem in dicht oder älteren Kultur, weil der Gliazellen Überwucherung zu bestimmen. Allerdings kann man für einen gesunden erscheinenden Neuronen (glänzend, elliptisch geformte Zellkörper unter Phasenkontrast-Mikroskopie) und intakten (nicht fragmentiert) Zellprozesse zu suchen. Es kann auch ein Problem mit der Kultur zu sein, wenn es Beweise für die sichtbare Verschmutzung oder schnell abbaubare Medium (immer nach nur 1-2 Tagen zwischen Medium ändert sauer).
   4. Was ist der Elektrodenimpedanz? Über verschiedene Zwecke verwendet, kann die Mikro-Elektroden oder die Isolierung eines MEA degradieren. NeuroRighter hat die Fähigkeit, die Elektrodenimpedanz zu beurteilen. ^{15 Regelmäßige} Impedanzmessungen um 1kHz sollte zwischen 10.000 und 100.000 Ohm-Bereich. Höhere Impedanzen empfehlen gebrochen führt oder Elektroden und Lesungen weniger als 10.000 Ohm empfehlen undichte Isolierung.
   5. Ist der Vorverstärker mit dem Hardware-Board? Der Vorverstärker sollte eine Ausgabe Kabel, das an der Hardware Board verbindet. Der Vorverstärker hat auch 4 kleine Stimulator-Boards, die auch zu den wichtigsten Hardware-Board anschließen und sind für die Stimulation nur wichtig.
   6. Haben die NeuroRighter Software-Einstellungen geändert wurden? Hardware-Konfiguration in der Software muss korrekt sein für die Aufnahme an die Arbeit. Installieren von aktualisierten Versionen und mehrere Benutzer die Einstellungen ändern können dies verursachen.
   7. Ist der MEA bei 35-37 ° C? Kühleren Temperaturen kann zu einer Reduzierung der spontanen Aktivität in kortikalen Netzwerken führen. Dies ist normalerweise kein Thema, da die Aufnahme erfolgt im Rahmen der Klima-kontrollierten Inkubator, aber man muss für Temperaturausgleich ermöglichen, wenn die MEA hat außerhalb des Inkubators für mehr als ein paar Sekunden.
   8. Hat das Medium in den letzten Stunden geändert worden? Wir haben beobachtet, die Kulturen oft anhalten Brennen für einige Stunden nach der Fütterung. Daher ist es am besten, Experimente, bevor die Fütterung befragen.
2. Elektrode mit übermäßiger Hintergrundgeräusche Sättigung der Aufnahme-Fenster:
   1. Ist der Vorverstärker pin Kontakt mit der Elektrode auf der MEA ausreichend? Dieses Problem kann durch eine falsch ausgerichtete Stift am Vorverstärker Deckel, ein kleines Stück Dreck, was einem Rückgang von Medium, einem herabgesetzten Elektrodenoberfläche oder überlappend klare Membran aus dem Deckel verursacht werden. Inspektion der Ansprechpartner für diese Fragen ist der erste Schritt. Einstellen der Pin mit einem Wattestäbchen in 70% igem Ethanol getränkten kann manchmal verbessern den Kontakt vor allem, wenn es ein Tropfen Medium, das Reinigen entfernt benötigt. Das Signal kann angezeigt werden schlimmer, bis das Ethanol verdampft. </ Li>
   2. Ist die Elektrode scheinen beschädigt werden? Visualisierung unter dem Lichtmikroskop kann manchmal Risse oder offenbaren entsteint Elektrodenisolation, die zu dieser Art von Artefakt.
   3. Sind die Kontaktflächen abgenutzt oder zerkratzt? Manchmal kann es mehrere Elektroden-Kontakten auf dem MEA, die schwer zu optimieren sind. Dies ist häufiger nach mehreren MEA verwendet und Beschichtungen. Ein Golddraht imprägnierten Gummi spacer führt nur in die Richtung seiner 0,5 mm Dicke und kann Vorverstärker pin Kontakt mit der MEA zu verbessern. Dieses Material ist erhältlich bei Fujipoly und kann nett sein, um die MEA und Deckel passen.
3. Entire MEA zeigt übermäßige Hintergrundgeräusche:
   1. Ist der MEA in die richtige Ausrichtung, so dass damit der Masseelektrode auf der MEA zu Boden Stift am Vorverstärker wenden? Wenn der MEA ist in der richtigen Ausrichtung dann gewährleistet gibt es keinen Bodenkontakt Fragen (2 ac oben) ist auch wichtig zu bedenken. Ist Kanal CR15 mit einem kurzen Kabel an den Vorverstärker-Chassis geerdet? Mit dem Jumper, sie durch interne 30 kOhm Widerstände Boden kann mehr Lärm führen.
   2. Gibt es Störungen aus den umliegenden Lichter, Stromquellen oder anderen Geräten? Eine der häufigsten Formen der Störung liegt bei 60 Hz von Beleuchtung und Geräte. Die Aufnahme muss ordnungsgemäß geerdet sein. Abschirmung freiliegende Kabel kann auch auf eine Verringerung Hintergrund Störungen hilfreich sein.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Dies ist ein Raster-Darstellung von 2 Minuten spontane Aktivität von einem neuronalen Netzwerk. Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Aktionspotential. Zwei Ausbrüche von Aktivität sind mit der blauen Pfeile angedeutet. Die Antwort auf mehrere Elektroden ist eine Funktion der Netzwerk-Konnektivität.

Abbildung 2. Hier ist ein Raster-Grundstück von 16 Sekunden von Stimulus-evozierte Aktivität. Rote Sterne repräsentieren Reize. Die roten Pfeile zeigen fünf Reize, die erfolgreich platzt der synaptischen Aktivität über mehrere Elektroden induziert. Gelegentlich wird ein Stimulus nicht zu einem Ausbruch, hier bei den blauen Pfeil.

Discussion

Dieses Protokoll zeigt Anleitungen zur Kultur und zu pflegen neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays sowie eine Einführung in die von der Aufnahme und anregende neuronale Netze. Einige der häufigsten Probleme bei der Aufnahme von MEAs wurden auch in der MEA Abschnitt zur Fehlerbehebung diskutiert. Es gibt gelegentliche Variationen in das Protokoll über diskutiert und oft sind diese Veränderungen genutzt werden, um spezifische Bedingungen durch bestimmte experimentelle Designs erforderlich zu optimieren.

Obwohl die Aufnahme und anregenden hier vorgestellte System unserer maßgeschneiderten NeuroRighter ¹⁵ mit der MCS-Vorverstärker besteht, gibt es mehrere andere Systeme, die eine Schnittstelle mit der neuronalen Netze bieten kann. Die Auswahl einer bestimmten Einrichtung wird von der jeweiligen experimentellen Anforderungen ab.

Simplistic Ableitung und Stimulation Beispiele wurden in diesem Protokoll vorgesehenen jedoch diese Kulturen auf MEAs verwendet werden, um Einblick in die komplexen Fragen rund um synaptische Aktivität und neuronale Netzwerk-Konnektivität zu liefern. Wie bereits erwähnt, die laufenden Arbeiten nutzt diese Technologie, um Prozesse wie zelluläre Plastizität Studie, Entwicklung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. ^6-10 So zeigte eine aktuelle Publikation aus unserem Labor reproduzierbar zielgerichtet in vitro Lernen mit real-time Closed Loop Stimulation in Antwort auf aktuelle neuronales Netzwerk Aktivität ^3.

Obwohl MEA Kulturen sind oft heikel und delikat, dank ihrer Einfachheit und Zugänglichkeit (im Vergleich zu gesunden Tieren), bieten sie ein leistungsstarkes Modell zum Studium der neuronalen Aktivität in einem Netzwerk-Ebene.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.