Hur Kultur, Spela in och stimulera neurala nätverk på mikro-elektrod Arrays (MEA)

Summary

Detta protokoll ger nödvändig information för att inrätta, vårda, inspelning från och elektriskt stimulerande kulturer på MEA.

Abstract

För det senaste århundradet har många neuroforskare runt om i världen vigt sina liv för att förstå hur neuronala nätverk fungerar och varför de slutar arbeta i olika sjukdomar. Studier har inkluderat neuropatologiska observation, fluorescerande mikroskopi med genetiska märkning och intracellulär inspelning i både dissocierade nervceller och beredningar skiva. Detta protokoll behandlar en annan teknik, som innebär växande dissocierade neuronala kulturer på mikro-elektrod kedjor (även kallad multi-elektrod arrayer, MEA).

Det finns flera fördelar med att använda detta system över andra teknologier. Dissocierade neuronala kulturer på MEA ge en förenklad modell där nätverksaktivitet kan manipuleras med elektrisk stimulering sekvenser genom matrisens flera elektroder. Eftersom nätverket är liten, är effekten av stimuleringen begränsat till observerbara områden, vilket inte är fallet i intakta förberedelser. De celler växer i en monolager att göra förändringar i morfologi lätt att följa med olika avbildningstekniker. Slutligen kan kulturer på MEA överleva i över ett år in vitro och som tar bort några tydliga tidsbegränsningar inneboende med andra odling tekniker. ¹

Vårt labb och andra runt om i världen utnyttjar denna teknik för att ställa viktiga frågor om neuronala nätverk. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla nödvändig information för att upprätta, vårda, inspelning från och elektriskt stimulerande kulturer på MEA. In vitro-nätverk är ett sätt för att ställa fysiologiskt relevanta frågor på nätet och cellnivå som leder till en bättre förståelse av hjärnans funktion och dysfunktion.

Protocol

A. Inledning

Det finns miljarder av nervceller i den mänskliga hjärnan. Alla dessa nervceller kan ha hundratals till tusentals anslutningar ofta gånger med många olika celler. Dessa anslutningar hamnen de signaler som tillåter oss att gå, spela piano, cykla, skratta, gråta och minnas. För det senaste århundradet har många neuroforskare runt om i världen vigt sina liv för att förstå hur neuronala nätverk fungerar och varför de slutar arbeta i olika sjukdomar.

Det finns många verktyg man kan använda när du tar den här till synes oöverstigliga uppgiften. Inledande studier har fokuserat på neuropatologiska observationer av hur neurala kretsar är organiserade i hjärnan hos människor och andra djur. Tillkomsten av fluorescensmikroskopi och genetiska märkning utökat omfattningen av dessa strukturella studier för att undersöka cellulära sammansättning ner till protein och DNA-nivå.

Men dessa försök inte ta itu med dynamisk funktion i hjärnan, bara den statiska arrangemang. För att förstå pågående neural aktivitet, populära tekniker generellt inriktas på att undersöka elektrofysiologiska aktivitet med intracellulära inspelning. Enstaka nervceller av dissocierade kulturer utgör en användbar reduktionistisk modell, men denna teknik är begränsad av korta tidsintervall för inspelning från enstaka celler. Denna modell ger också begränsad information om andra celler i nätverket. Hjärnan skivor från gnagare ger mer av en realistisk modell där kortikala arkitektur bibehålls. Men sådana skivor, även när odlade, har en begränsad livslängd och kan vara tekniskt utmanande att hålla vid liv med bibehållen cytoarchitecture ^2.

En annan teknik innebär växande dissocierade neuronala kulturer på mikro-elektrod kedjor (även kallad multi-elektrod arrayer, MEA). Nervceller är klädd på multilaterala miljöavtal som har microelectrodes inbäddade i botten av skålen. Under tre veckor, dessa kulturer bilda nätverk av nervceller komplett med axoner, dendriter och hundratals om inte tusentals synapsförbindelser. Det finns flera fördelar med att använda detta system över andra teknologier. Dissocierade neuronala kulturer på MEA ge en förenklad modell med att arbeta (på order av en enda kortikala kolumn i stället för en intakt hjärna). De celler växer i en monolager att göra förändringar i morfologi lätt att följa med olika avbildningstekniker. Nätverksaktivitet kan manipuleras med elektrisk stimulering sekvenser genom matrisens flera elektroder. Eftersom nätverket är liten, är effekten av stimuleringen begränsat till observerbara områden, vilket inte är fallet i intakta förberedelser. Slutligen kan kulturer på MEA överleva i över ett år in vitro och som tar bort alla tydliga tidsbegränsningar inneboende med annan odling tekniker. ¹ Därför kulturer på MEA representerar en idealisk modell för att studera neuronala anslutning.

Vårt labb och andra runt om i världen utnyttjar denna teknik för att ställa viktiga frågor om neuronala nätverk. Aktuell neuronala processer som studeras med denna modell inkluderar nätverk dynamik, utveckling, inlärning och minne, synaptisk plasticitet, excitotoxicity, ischemi och neurodegeneration. ^3-10 Resultat från dessa studier kan få betydande konsekvenser för upprättande bättre behandlingar för mänskliga sjukdomar som medfödda missbildningar, epilepsi , stroke och Alzheimers sjukdom. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla nödvändig information för att upprätta, vårda, inspelning från och stimulerande kulturer på MEA. Det slutliga målet är att tillhandahålla ett sätt för forskare att ställa fysiologiskt relevanta frågor på cellulär och nätverk nivåer som kanske kan leda till en bättre förståelse för hjärnans funktion och dysfunktion och slutligen behandling av sjukdomar som drabbar våra nervceller och hur de kommunicerar.

Följande protokoll utgör över 10 års erfarenhet från våra labb i odling, inspelning från och stimulerande neuronala nätverk på mikro-elektrod arrayer. Varje steg har optimerats så att leda till utvecklingen av långa överlevande friska neuronala nätverk. Referenser finns om tillgängligt medan några optimala inställningar vi bestäms empiriskt. Före initiering av protokollet, skaffa utrustning och tillbehör och förbereda lösningar som anges i avsnittet "Material". Avsnittet om "Brain Dissection" kommer att kortfattat diskuteras, men inte visat i den medföljande videon som andra tidning visualiseras Experiment artiklar handlar om detta ^11.

B. Brain Dissection

1. Hela hjärnor utvinns från embryonala dag 18 (E18) råttor. Begränsad-dräktiga honråttor bedövas med inhalerade isofluran och halshuggen. Embryon tas bort och dissekeras enligt National Research Council GUIDe för vård och användning av försöksdjur med hjälp av ett protokoll som godkänts av Emory University IACUC.
2. Samtidigt använder aseptisk teknik, är den embryonala hjärnan bort och placeras i kallt Hanks Balanced Salter lösning (HBSS) i en 100 mm steril petriskål. Resten av dissektion protokollet sker under en dissekera mikroskop i ett laminärt flöde huva för att minimera risken för kontaminering.
3. Råttan hjärnor överförs en i taget till en andra steril petriskål med HBSS för dissekering. Medan nedsänkt i HBSS är hjärnstammen, thalamus och cerebellum skära bort och hjärnhalvorna är genomskärs.
4. Den lukt tubercle används som handtag för att säkra halvklotet samtidigt försiktigt bort hjärnhinnorna.
5. Hjärnbarken sedan skalas bort från den underliggande hippocampus och striatum och förvaras i en steril 15 ml koniska rör i viloläge lösningen på is. ¹² Eftersom det oftast finns flera embryon, är denna procedur upprepas sedan beroende på önskad rad åtgärder som ska pläterade och önskad celltäthet. Cortex är kombinerade för cellen dissociation processen som diskuteras nedan. Cortex kan förvaras vid 4 ° C i viloläge lösning för upp till 24 timmar före dissociation med endast minimal förlust av cellernas livskraft. Som ett alternativ till att använda vävnaden upp i egen regi, kan dissekeras hjärnvävnad kan köpa från Brain bitar ( www.brainbitsllc.com ).

C. MEA förberedelse och kortikala dissociation

1. Den MEA hämtas från ALA Scientific ( www.alascience.com ), en leverantör för tillverkaren, Multi-Channel Systems. Det finns flera olika konfigurationer till MEA med variationer i elektrod orientering och avstånd, närvaro eller frånvaro av en intern jordelektroden, närvaro eller frånvaro av ett glas ring, och storleken på glaset ringen. För våra grundläggande experiment använder vi den vanliga mikro-elektrod array som innehåller 60 elektroder i en 8 av 8 rutnät överenskommelse med ett litet glas ring. Den titannitrid elektroden diameter är 30 ìm och avståndet mellan elektroden centra är 200 ìm. En av elektroderna är större och fungerar som marken eller inre referenselektrod. Vid hantering av MEA, är det mycket viktigt att inga fasta föremål (t ex pipettspetsar, vävnader papper eller poliser gummi) någon gång på insidan av skålen eftersom detta kan skada elektroderna. Mer detaljerad information om multilaterala miljöavtal och hantering finns i MEA instruktionsbok ( www.multichannelsystems.com / products-MEA / mikroelektrod-arrays.html ).
2. På kvällen före cellberedningen, är MEA sköljs med avjoniserat vatten och sedan får suga i 70% etanol i 15 minuter. Disken placeras sedan i ett laminärt flöde huva med UV-ljus på natten. För hantering ändamål, är varje MEA placeras i en standard 100 mm steril polystyren petriskål med datum och märkningen placeras på petriskål. Notera andra sterilisering tekniker inklusive autoklavering och använda vatten vid 90 ° C nämns i MEA bruksanvisningen. Vi har dock funnit empiriskt att autoklavering verkar minska antalet gånger som en MEA kan användas. Om du återanvänder MEA som för närvarande har olika kulturer, då organiskt material måste tas bort. 300-400 ìl 0,25% trypsin i PBS inkuberas på MEA vid 35-37 ° C i 20 minuter. MEA sköljs med avjoniserat vatten och därefter kontrolleras med ett ljusmikroskop. Om cellulära roll fortfarande, då trypsin steg upprepas tills ren. Om skålen är ren, fortsätt sedan med sterilisering steg som ovan. I allmänhet kan MEA återanvändas flera gånger med rätt vård.
3. Också på kvällen före plätering, är MEA lock förberedd och autoklaveras. Locken är specialtillverkade men kan också köpas från ALA-Scientific. De är gjorda av polytetrafluoreten teflon och har en tydlig membran (fluorerad etylen-propylen teflon) sträckte sig över toppen. Membranet gör att diffusion av gaser men begränsar spridningen av vatten och därmed praktiskt taget eliminerar behovet av en fuktad atmosfär och förebygga de skadliga effekterna av avdunstning och hyperosmolaritet. ¹
4. När dissektion ovan är klar MEA förberedelser fortsätter genom att placera 100 ìl polyethyleneimine (PEI) lösning i mitten av varje MEA. ¹³ i våra händer, ger PEI lösning mindre gruppering av celler i MEA än att använda polylysine. Skålen får sitta vid rumstemperatur i laminärt flöde huva i 30 minuter med lock lätt vilande på MEA för att förhindra avdunstning. Som en påminnelse bör alla arbeta med öppna MEA eller hjärnvävnad ske i en vanlig cell kultur laminärt flöde huva till miniminimera risken för kontamination.
5. MEA är sedan sköljas tre gånger med 1-2 ml sterilt avjoniserat vatten. Den idealiska laminärt flöde huva set-up kommer att innehålla en aspirator apparat för att avlägsna vätska från rätter. En steril 200μl pipettspetsen kan fästas på aspirator slangen. Rör inte ytan på MEA, medan aspirerande eftersom detta kan skada elektroderna. Efter den sista sköljningen är MEA får torka i minst 30 minuter i laminärt flöde huven.
6. Under denna torktiden är neuronala dissociation process som inleddes genom att placera cortex i 2 ml papain lösning i en 15 ml steril koniska plast flaskan. ¹ 50 ìl DNAse läggs till blandningen. Flaskan placeras i vattenbad vid 35-37 ° C och inkuberas i ca 20 minuter. Knacka försiktigt på lösningen var 5 minuter för blandning Var noga med att undvika att införa bubblor. Den cortex ska börja ta på en suddig utseende som den matsmältningen vinning.
7. Den papain Lösningen är sedan försiktigt bort genom att pipettera lämna cortex i 15ml koniska flaskan. 2 ml av cell mediet läggs till i cortex, får inkubera i 2-3 minuter och sedan försiktigt bort. Detta för att tvätta bort alla rester av papain, som också kommer att hämmas av serum i mediet. En annan 2ml av cell mediet läggs till i cortex och detta prov är då vortexed på hög hastighet i 5-10 sekunder. Det bör finnas en grumlig lösning i botten av 15ml koniska flaskan och inget resterande bitar hjärnan. Alternativt trituration med 1 ml medium genom 3 gånger med en P-1000 handhållna pipett kan användas för isär vävnaden. ¹ För korrekt trituration bör varje pipett stroke ta en sekund.
8. Lösningen är då tillåts passera försiktigt genom ett sterilt 40μm cell sil via gravitation. Tillsätt långsamt cellen lösningen en droppe i taget i silen med en P-1000. En 35 mm steril petriskål används för att samla in den ansträngda cellen lösningen.
9. Cellsuspensionen överförs sedan tillbaka till en 15 ml konisk flaska och cellen mediet läggs till en slutlig volym på 4,0 ml. ¹⁴
10. 500 l av en 5% w / v BSA lösning är sedan försiktigt lager i botten av 15ml koniska flaskan med en P-1000. ¹⁴ Detta kommer undan cellen som innehåller lösning uppåt i flaskan.
11. Cellen lösning med BSA lager i botten sedan centrifugeras i 6 minuter vid 200 xgi att ta bort små skräp och potentiellt giftiga intracellulära innehåll. ¹⁴
12. Under cellen centrifugeringssteget, är MEA visuellt avvägas så att de är helt torra. 20 ìl av laminin lösning är sedan försiktigt placeras i mitten av MEA se till att alla elektroder är täckta. ¹ Undvik att införa luftbubblor i denna lösning eftersom det kan leda till bristande beredningen av elektroden ytan. Om MEA inte är helt torr, då droppe laminin ska sprida sig över skålen eventuellt gör det svårare tillräckligt för att lokalisera celler över elektroderna vid plätering. Detta steg är mycket känslig och har potential att leda till MEA ytskador med en ostadig hand eller förfaller i uppmärksamhet.
13. Den Teflon Locken placeras på MEA vid denna tidpunkt för att förhindra avdunstning av laminin. Placering av locket är också känslig. Ett lock ska endast placeras eller tas bort när MEA är på en helt plan yta. Annars kan extra krafter som utövas av en ojämn yta spricker glaset botten av arrayen gör den obrukbar. Skålen placeras sedan in i inkubatorn i 20 minuter.
14. Medan laminin är bindande till skålen är 15 ml koniska injektionsflaskan som innehåller celler bort från centrifugen och överförs tillbaka till den laminära flödet huven. En pellets ska synas i botten av flaskan. Supernatanten försiktigt bort med en steril 5ml plast serologisk pipett. Spara supernatanten ifall centrifugeringen var ofullständig. Pelleten är då återsuspenderade försiktigt antingen trituration med en P-1000 eller en snabb virvel i 300-500 l av cell medelhög beroende på den förväntade avkastningen. 10 l cellsuspension tas bort och placeras på en hemacytometer att bestämma cellkoncentrationen. Om avkastningen är låg, analysera supernatanten under mikroskop för att avgöra om centrifugeringssteget var ofullständig. Upprepa centrifugeringen kan vara nödvändig. Om avkastningen är hög, då en utspädning kan vara nödvändigt för noggrannare räkning. Cell plätering densitet kan variera från 5.000 till 300.000 celler per MEA. Beräkna en utspädning så att önskat antal celler för plätering är i en slutlig volym på 15-20 l. Vi använder normalt en slutlig koncentration av 1000 till 3000 celler per mikroliter. Ett par cortex kommer vanligtvis ge mellan 10 och 15 miljoner celler. Detta nummer kan vara något lägre om trituration utnyttjas.
15. Vid denna tid, tHan laminin inkubationstiden på MEA ska vara kompletta. Den Teflon locket tas bort från MEA och de flesta av laminin fallhöjden är vakuum aspirerade eller pipetteras bort. Sedan 15-20 l av önskad cellsuspensionen omedelbart pipetteras på den kvarvarande våta området laminin. Var noga med att undvika att införa luftbubblor i denna lilla volym cellsuspension som luftbubblor kan förhindra att celler från jämnt täcker alla av elektroderna. Locket är lätt ersättas och MEA är försiktigt placeras tillbaka i inkubatorn i 30 minuter. Skålen är då inspekteras under ljusmikroskop för att säkerställa att cellerna har följt och omfattar alla av elektroderna. Om alla elektroder inte omfattas, då fler celler kan läggas till och MEA läggs tillbaka i inkubatorn med lock på för att dessa nya celler följa. Om ett rör cellsuspension används mer än några minuter efter att ha suttit ostört, se till att snurra försiktigt till resuspendera bosatte celler. När tillräckligt elektrod täckning uppnås, då skålen långsamt översvämmad med 1 ml varmt (35-37 ° C) cell medium. Den Teflon locket ersätts och skålen är placerad bak i inkubatorn. Den laminärt flöde huven kan snabbt torka de små laminin volymer och cell volymer suspension en gång på MEA så noga med att hålla dem förseglas med Teflon lock. Den idealiska inkubatorn miljö för förseglade MEA är 5% CO _2, 9% O ₂ och 65% luftfuktighet vid 35-37 ° C. Låg syrgaskoncentrationen är viktigt för långsiktig kulturer, vilket minskar oxidativ skada. ¹² Underhåll 65% luftfuktighet minskar avdunstningen genom Teflon membran (jämfört med ingen fuktstyrning) och låter MEA elektronik som ska användas i inkubatorn utan skador från kondens (som med en vanlig inkubator fuktig till mättnad).

D. Ändra cell medellång och ta hand om dissocierade kulturer på MEA

1. Dagen efter cellen bordläggning, inspektera MEA under ljusmikroskop. Om färgen på mediet är fortfarande persika till röda i färgen och det finns en begränsad mängd av cellulära skräp och celldöd, så det första medium förändring kan försenas en annan dag. Men om mediet börjar synas mer orange eller gul färg och / eller det finns en stor mängd av cellulära skräp och celldöd, sedan byta medium. Alla medelstora förändringar bör ske i en vanlig cell kultur laminärt flöde huva.
2. Det första mediet förändringen består i att ta bort MEA locket, aspirerande bort alla av mediet i skålen, som ersätter den mängd bort med färska cell medium, och sedan ersätta locket. Byt ut hela beloppet i cellen medium på det första medium förändringen att undanröja eventuella återstående cellulärt skräp från bordläggningen processen. Efterföljande medelstora förändringar bör endast aspirera bort ungefär hälften av de medel följt genom att ersätta den mängd bort med färska medium. Detta gör att några av de tillväxtfaktorer som har utsöndras i cellen mediet att vara med cellerna upprätthålla en mer optimal uppväxtmiljö. Om undersidan av locket är kontaminerad under mediet föränderlig process, eller om locket visar tecken på skada eller löst sittande, sedan använda en ny autoklaveras lock. Cell medium kan förvaras i kuvös i en steril behållare med en modifierad anpassad lock (som har en Teflon (fluorerad etylen-propylen) membran för att möjliggöra för gasformiga utbyte). Cell medium kan också lagras vid 4 ° C men varmt och balansera detta i inkubatorn innan du byter medium.
3. Ta bort och byta ut ungefär hälften av mediet i en skål ungefär två gånger i veckan. Vissa celler preparat kan leda till en snabbare färgförändringar på medellång orsakar ett behov av mer frekventa förändringar. Om mediet noteras vara gula, sedan ändra hela beloppet av medium. Snabb övergång till gul kan också vara ett tecken på smitta så inspektera skålen under ljusmikroskop för visuell tecken på infektion.
4. Beroende på experiment villkor och steril teknik, kan kulturer som har försiktigt vårdas överleva i mer än ett år. ¹

E. Inspelning från MEA

1. Varje MEA har 59 in elektroder och en intern jordelektrod. Det finns flera kommersiella inspelning system som finns samt kundanpassade versioner. Leverantörer inkluderar Multi-Channel Systems, Tucker Davis Technologies, Axion Biosystems, Alpha Med vetenskapliga MED64, Plexon, Ayanda Biosystems och biologisk. Vårt laboratorium använder för närvarande en kommersiell installation av Multi-Channel Systems, en specialdesignad Windows-baserat system som kallas NeuroRighter ^15, och en specialdesignad Linux-baserade system som kallas MeaBench ^16. Vart och ett av dessa system har möjlighet att spela in från MEA (Multi-Channel System) med en Multi-Channel Systems förförstärkare. En kommersiell installation från Tucker Davis Technologies är också i bruk. Detta protokoll kommer att demonstrera inspelning från MEA med NeuroRighter. NeuroRighter programvara är öppen källkod och finns för gratis nedladdning tillsammans med maskinvaran mönster på NeuroRighter Google grupper. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Kulturer på MEA ta 2-3 veckor för att nå ett stabilt tillstånd av aktivitet. ^17,18 Denna aktivitet inkluderar spontana aktionspotentialer och kultur i hela spricker (en störtflod av aktionspotentialer som sprider synaptically över en kultur). Den typ av experiment men kommer att avgöra den ideala antalet dagar in vitro före inspelning.
3. Nervaktivitet är beroende av idealiska miljöförhållanden, inklusive temperatur och pH. ¹ Som ett resultat tar vår inspelning plats i inkubatorn som beskrivs ovan. Om korta experiment (<30 minuter) är utformade, finns det också en kommersiellt tillgänglig värmemodul som kan anslutas till MCS förförstärkare för att upprätthålla den perfekta MEA temperatur.
4. Vill börja spela, är en MEA (fortfarande i sin petriskål) överförs försiktigt från lagring inkubatorn till inspelningen inkubatorn. Håll botten av skålen parallellt med marken. Undvik snabba rörelser med MEA eller skärande MEA eftersom dessa kan lossa kulturen från underlaget. MEA tas sedan bort från petriskål som ställs i inspelningen förförstärkare. Matcha interna jordelektroden i rätter som vi nu visar med marken elektrod på förförstärkaren (kanal CR15 för MCS förförstärkare). Torka kontakterna runt i ytterkanten av MEA med hjälp av en vävnad eller bomullspinne fuktad med 70% etanol för att ta bort fingeravtryck eller annat skräp som kan hindra en bra anslutning. Efter att MEA sitter rätt, är förförstärkare locket därefter sänks och hakade på plats. Kontakterna på förförstärkaren locket ska vila stadigt på kuddar elektroden kontakten på MEA. Inspektera kontakt anpassning och justera med en bomullspinne om det behövs. Placera förförstärkare på Peltier-enheten i inkubatorn. Denna består av två koppar plattor med ett Peltier termoelektrisk värmepump inklämt mellan dem. Vi kör detta på ca 5 V, för att ta bort en del av värmen som produceras av förförstärkare kretsar. Detta förhindrar att kondens bildas på insidan av teflon membranet locket. Varje kondens skulle indikera skada kulturen genom ökad osmolaritet mediet i kontakt med cellerna, på grund av avdunstning. Genom att säkerställa att förförstärkare och mediet är en grad eller två under inkubatorn luftens temperatur, förändringar i osmolaritet minimeras.
5. Slå på strömmen till NeuroRighter och öppna program på arbetsstationen. Justera NeuroRighter inställningar för att in vitro med lämplig mjukvara / hårdvara konfigurationer också på plats. Välj antal elektroder i programvaran. För att minska mängden bakgrundsljud, kan ett digitalt bandpassfilter vara aktiverat. Välj en datafil med posten slå på om data ska sparas för senare analys. Aktivera start-knappen när alla lämpliga inställningar väljs.
6. Skärmen ska visa att köra spår av aktivitet och bakgrundsljud. Enstaka aktionspotentialer och fat stort utbrott av verksamhet bör vara synliga. Avsnittet nedan om felsökning inspelning från MEA kommer att diskutera flera vanliga frågor om förväntad verksamhet inte visualiseras.
7. Skärmen uppfattning kan ändras för att spika avkänningsläge ("Spk Wfms fliken) där aktionspotentialer visas statiskt som de förekommer i Windows 3ms tid. För en given kanal, bör verkligt extracellulära aktionspotentialer senaste ca 1ms och bör brand flera gånger i samma riktning (positiv eller negativ). Ibland kan två eller fler nervceller vara synliga på samma elektrod med olika polaritet. Spikes med kort kurs och rörlig polaritet sannolikt artefakt. Figur 1 visar ett raster tomt på spik data.
8. Skärmen uppfattning kan ändras till lokala fältet potentialer (LFPs) för en titt på lokalisera ursprunget till sprängning aktivitet. Denna typ av inställning kan vara mer praktiskt att spela in vivo eftersom monolayer kulturer har svaga LFPs. Notera några förförstärkare (inklusive en som vi använder från Multi-Channel System) har högpassfilter vid 10 Hz som kommer att dämpa lägre rytmer frekvens LFP.

F. stimulera neuronala nätverk på MEA

1. Samma 59 registreringselektroderna på en MEA kan också utnyttjas för att stimulera kulturen. Den typ av experiment kommer att avgöra graden av stimulans. NeuroRighter ger flexibilitet för stimulering experimentell design eftersom det är öppen källkod. ¹⁵
2. Utmaningen med att stimulera en kultur är att den stimulans skapar en artefakt som kan vara flera millisekunder. Denna artefakt kan vara stor nog att utlösa spik upptäckt och oklara svar stimulans. NeuroRighter utnyttjar Salpa algoritm för att minimera och i vissa fall väsentligt att eliminera den stimulans artefakt. ¹⁹
3. För att stimulera det neuronala nätverket på MEA, tränar Salpa algoritmen under "Inspelning fliken Inställningar för att begränsa stimulans artefakt. Aktivera Salpa i "Online fliken Inställningar. Välj ett filnamn och klicka på Start-knappen som tidigare för att börja inspelningen. Klicka sedan på "Stim-fliken. Det finns många alternativ för att inrätta stimulering på denna sida.
4. Ett enkelt experiment är att stimulera en elektrod och titta på lyhördhet av skålen genom den öppna loopen avsnittet. Välj den hastighet, spänning, fas bredd och kanalnummer. Tryck på startknappen i det öppna loop avsnitt. Svaren på denna stimulering kan visualiseras på huvudsidan "Spikes"-fliken och "Spk Wfms fliken och analyseras i datafiler.
5. I realtid, kan brister visualiseras i en tid-låsta sätt en ett hertz stimulans av 0.5V över flera elektroder. Figur 2 visar ett raster tomt på en post-stimulus respons. Innan observationer har visat att det finns två olika typer av stimulans frammanade-verksamhet:. Direkt framkallade aktionspotentialer (dAPs) och synaptically evoked potentials åtgärd (SAPS) ²⁰
6. Nervceller i kultur har spontana utbrott av aktivitet. För vissa experiment, kan denna typ av spricka störa försöker styra nätverket dynamik. Intressant nog kan distribueras stimulans på 1-2 Hz per elektrod börja undertrycka spricker aktivitet i ett neuronalt nätverk på en MEA. ²¹

G. Felsökning inspelning från MEA

1. Inga aktionspotentialer eller brister som finns i MEA när programvaran är påslagen:
   1. Är kultur gammal nog? Aktionspotentialer ska synas mot slutet av den första veckan in vitro. Sprängning sker cirka två till tre veckor in vitro.
   2. Är hårdvaran får ström? Det NeuroRighter Systemet använder två 6V blybatterier för att driva hårdvaran. Strömbrytaren måste vara i läge och laddade batterier.
   3. Är kulturen vid liv? Ibland kan detta vara svårt att avgöra, särskilt i tät eller äldre kultur på grund av gliacellsmarkörer överväxt. Men man kan leta efter friska visas nervceller (glänsande, elliptiska formade cellen organ under faskontrast mikroskopi) och intakt (inte splittrade) cell processer. Det kan också finnas ett problem med kulturen om det finns belägg för synliga föroreningar eller snabbt förnedrande medium (blir sura efter bara 1 till 2 dagar mellan medelstora förändringar).
   4. Vad är den elektrod impedans? Under flera användningsområden, kan mikro-elektroderna eller isoleringen i en MEA försämras. NeuroRighter har förmågan att bedöma elektrodimpedans. ¹⁵ Normal impedans mätningar runt 1kHz bör variera mellan 10.000 och 100.000 Ohm. Högre impedans föreslår brutna leder eller elektroder och avläsningar mindre än 10.000 Ohm antyder läckande isolering.
   5. Är förförstärkare anslutna till hårdvaran styrelsen? Den förförstärkare bör ha en effekt kabel som ansluts till hårdvaran ombord. Den förförstärkare har också 4 små stimulator styrelser som också ansluter till de viktigaste hårdvara styrelsen och är viktiga för stimulering bara.
   6. Har NeuroRighter programinställningarna ändrats? Hårdvarukonfiguration inställningarna i programvaran måste vara korrekt för inspelning ska fungera. Installera uppdaterade versioner och flera användare att ändra inställningar kan orsaka detta.
   7. Är MEA vid 35-37 ° C? Svalare temperaturer kan leda till en minskning av spontan aktivitet i kortikala nätverk. Detta är vanligtvis inget problem eftersom inspelningen sker inom klimat-kontrollerade inkubator, men man måste medge temperatur jämvikt om MEA har varit utanför inkubator för mer än några sekunder.
   8. Har mediet har förändrats under de senaste timmarna? Vi har observerat de kulturer ofta sluta skjuta flera timmar efter utfodring. Därför är det bäst att göra experiment innan utfodring.
2. Elektrod med höga bakgrundsljud mättar inspelningen fönstret:
   1. Är förförstärkaren pin kontakt med elektrod på MEA tillräcklig? Detta problem kan orsakas av ett dåligt stift på förförstärkaren locket, en liten bit av skräp, en droppe av medium, en förstörd elektrod yta, eller en överlappande klart membran från locket. Inspektion av kontakten för dessa frågor är första steget. Justering av stiftet med en bomullstuss indränkt i 70% etanol kan ibland förbättra kontakten speciellt om det fanns en droppe av medium som behöver renas bort. Signalen kan visas värre tills etanolen avdunstar. </ Li>
   2. Har elektroden verkar vara skadad? Visualisering under ljusmikroskop kan ibland avslöja spruckna eller urkärnade elektrod isolering som leder till denna typ av artefakt.
   3. Är kontakten kuddar sliten eller repad? Ibland kan det finnas flera elektrod kontakter på MEA som är svåra att optimera. Detta är mer vanligt efter flera MEA användningsområden och ytbehandlingar. En guldtråd impregnerat gummidistans genomför endast i riktning mot dess 0.5mm tjocklek och kan förbättra kontakten förförstärkare stift med MEA. Detta material är tillgängligt från Fujipoly och kan vara söta för att passa MEA och lock.
3. Hela MEA visar alltför bakgrundsljud:
   1. Är MEA i rätt riktning så att marken elektrod på MEA till kontakt med marken stift på förförstärkare? Om MEA är i rätt riktning sedan se finns det inga markkontakt frågor (2 ac ovan) är också viktigt att tänka på. Är kanal CR15 jordad med en kort kabel till förförstärkaren chassit? Med hjälp av bygel till jord det genom interna 30 kOhm motstånd kan leda till onödigt buller.
   2. Finns det störningar från omgivande ljus, strömkällor eller andra delar av utrustningen? En av de vanligaste formerna av störning är 60 Hz från lampor och utrustning. Inspelningen Systemet måste vara korrekt jordad. Skärmning exponerade kablar kan också vara till hjälp att minska bakgrunden störningar.

Representativa resultat

Figur 1. Detta är ett raster tomt på 2 minuter spontan aktivitet från en neuronala nätverket. Varje svart prick representerar en aktionspotential. Två utbrott av aktivitet markeras med blå pilar. Responsen över flera elektroder är en funktion av nätverksanslutning.

Figur 2. Här är en raster tomt på 16 sekunder av stimulans frammanade-aktivitet. Röda stjärnor representerar stimuli. De röda pilarna visar fem stimuli som framgångsrikt inducerad skurar av synaptisk aktivitet över flera elektroder. Ibland inte ge en stimulans inte en spricka, här på den blå pilen.

Discussion

Detta protokoll visar instruktioner om hur kultur och bevara neuronala nätverk på mikro-elektrod arrayer samt en introduktion till inspelning från och stimulerande neuronala nätverk. Några av de vanligaste problemen vid inspelning från MEA diskuterades också MEA avsnittet Felsökning. Det finns vissa variationer i det protokoll som diskuterats under och ofta dessa förändringar används för att optimera särskilda villkor som krävs av vissa experimentell design.

Även om inspelningen och stimulerande system som presenteras här består av våra specialdesignade NeuroRighter ¹⁵ med MCS förförstärkare, det finns flera andra system som kan ge ett gränssnitt till neuronala nätverk. Att välja en viss inställning beror på den specifika experimentella behov.

Förenklade inspelningen och exempel stimulering gavs i detta protokoll dock dessa kulturer på MEA kan användas för att ge insikt i komplexa frågor om synaptisk aktivitet och neuronala nätverksanslutning. Som nämnts ovan pågår arbetet använder denna teknik för att studera processer som cellulära plasticitet, utveckling, excitotoxicity och neurodegeneration. ^6-10 Till exempel visade en nyligen publicerad från vårt laboratorium reproducerbara målinriktad inlärning in vitro i realtid med återkoppling stimulans i svar på dagens neuronala aktiviteten inom nätverket ^3.

Även MEA kulturer är ofta petiga och känsliga, tack vare sin enkelhet och tillgänglighet (jämfört med intakta djur), ger de en kraftfull modell för att studera neuronal aktivitet på ett nätverk nivå.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.