Summary
Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar.
Abstract
Geçen yüzyıl boyunca, dünyanın pek çok Nörobilimadamları nöral ağların nasıl çalıştığını anlamak için hayatlarını adamış ve çeşitli hastalıkların neden çalışmayı durdurur. Çalışmalar nöropatolojik gözlem, genetik etiketleme ile floresan mikroskopi ve ayrışmış nöronlar ve dilim hazırlıkları hem de hücre içi kayıt dahil ettik. Bu protokol, mikro-elektrot dizileri (aynı zamanda multi-elektrot diziler, ÇÇA denir) ayrışmış nöronal kültürlerin büyüyen içeren bir başka teknoloji tartışıyor.
Diğer teknolojilere kıyasla, bu sistemi kullanarak birden fazla avantajı vardır. ÇÇA üzerindeki kontrol grubuyla nöronal kültürlerin ağ aktivite dizinin birden fazla elektrotlar üzerinden elektrik stimülasyonu dizileri ile manipüle edilebilir olan basitleştirilmiş bir model sağlar. Ağ küçük olduğundan, stimülasyon etkisi gözlemlenebilir alanları, bozulmadan hazırlıklarında söz konusu değildir sınırlıdır. Çeşitli görüntüleme teknikleri ile izlemek için morfolojisi kolay değişiklik yapmadan bir tek tabaka hücreleri büyümek. Son olarak, in vitro olarak bir yıl boyunca diğer kültür teknikleri ile doğasında herhangi bir net zaman sınırlamaları kaldırır ÇÇA üzerindeki kültürleri hayatta. 1
Dünya çapında laboratuvar ve diğerleri nöron ağları hakkında önemli sorular sormak için bu teknolojiyi kullanıyor. Bu protokolün amacı, bakımını kurma gelen kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlamak için, ağ fizyolojik ilgili sorular soran ve daha iyi anlaşılmasına yol açan hücre düzeyine için bir araç sağlayan in vitro ağlarda beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu.
Protocol
A. Giriş
Milyarlarca insan beyninin nöron vardır. Bu nöronların her birinin birçok farklı hücre ile yüz binlerce bağlantılarının çoğu kez olabilir. Bu bağlantılar bir yürüyüş bizi, bir piyano çalmak, bisiklete binmek, gülmek, ağlamak ve hatırlamak için izin sinyalleri barındırır. Geçen yüzyıl boyunca, dünyanın pek çok Nörobilimadamları nöral ağların nasıl çalıştığını anlamak için hayatlarını adamış ve çeşitli hastalıkların neden çalışmayı durdurur.
Bu aşılmaz gibi görünen görev alırken kullanabileceğiniz birçok araç vardır. Nöral devreleri, insan ve diğer hayvanların beyinlerinde nasıl organize edilir nöropatolojik gözlem ilk çalışmalar üzerinde duruldu. Floresan mikroskopi ve genetik etiketleme gelişiyle hücresel protein ve DNA düzeyinde kompozisyon aşağı keşfetmek bu yapısal çalışmaların kapsamı genişletilmiştir.
Ama bu deneylerde, beynin sadece statik düzenleme dinamik fonksiyon adresi vermedi. Devam eden nöral aktivitenin anlaşılması için, popüler teknikler genellikle hücre içi kayıt elektrofizyolojik aktiviteyi inceleyerek odaklanmak. Ayrışmış kültürlerin tek nöronlar, faydalı indirgemeci model, ancak bu tekniğin tek hücre kayıt için kısa zaman aralıkları ile sınırlı bir sağlar. Bu model aynı zamanda ağdaki diğer hücreler hakkında sınırlı bilgi sağlar. Kemirgenler Beyin dilim kortikal mimarisini muhafaza gerçekçi bir model daha sunuyoruz. Ama Dilimler, kültür bile zaman, sınırlı bir ömrü vardır ve hücre mimarisini 2 korurken canlı tutmak için teknik olarak zor olabilir.
Bir başka teknoloji, mikro-elektrot diziler (çoklu elektrot diziler, ÇÇA de denir) büyüyen ayrışmış nöronal kültürlerin içerir. Nöronlar çanak alt Mikroelektronlar gömülü ÇÇA üzerine kaplanmıştır. Üç hafta boyunca, bu kültürlerin aksonlar, dendritler ve yüzlerce olmasa bile binlerce sinaptik bağlantıları ile tam bir nöron ağları oluşturmaktadır. Diğer teknolojilere kıyasla, bu sistemi kullanarak birden fazla avantajı vardır. ÇÇA üzerinde çalışmak için basitleştirilmiş bir model (tek bir kortikal sütun sırasını yerine sağlam bir beyin) grubuyla aynı nöronal kültürlerin sağlar. Çeşitli görüntüleme teknikleri ile izlemek için morfolojisi kolay değişiklik yapmadan bir tek tabaka hücreleri büyümek. Ağ etkinliği dizinin birden fazla elektrotlar üzerinden elektrik stimülasyonu dizileri ile manipüle edilebilir. Ağ küçük olduğundan, stimülasyon etkisi gözlemlenebilir alanları, bozulmadan hazırlıklarında söz konusu değildir sınırlıdır. Son olarak, in vitro olarak bir yıl boyunca diğer kültür teknikleri ile doğasında herhangi bir net zaman sınırlamaları kaldırır ÇÇA üzerindeki kültürleri hayatta. Bu nedenle 1 ÇÇA üzerindeki kültürleri nöronal bağlantı çalışmak için ideal bir model temsil eder.
Dünya çapında laboratuvar ve diğerleri nöron ağları hakkında önemli sorular sormak için bu teknolojiyi kullanıyor. Bu model ile çalışılmaktadır Şu nöronal süreçleri ağ dinamiklerini, gelişme, öğrenme ve bellek, sinaptik plastisite, eksitotoksisitesi, iskemi ve nörodejenerasyon dahil 3-10 bu çalışmalardan elde edilen bulgular, konjenital malformasyonlar gibi insan hastalıkları, epilepsi için daha iyi tedaviler kurulması için önemli etkileri olabilir . , inme ve Alzheimer hastalığı. Bu protokolün amacı, kayıt ve kültürler ÇÇA üzerinde uyarıcı, bakım, kurma için gerekli bilgileri sağlamaktır. Nihai hedefi, araştırmacılar, belki de, beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu daha iyi bir anlayış ve sonuçta bizim nöronlar ve bunların nasıl iletişim etkileyen hastalıkların tedavisinde yol açabilir hücresel ve ağ seviyelerinde fizyolojik ilgili soru sormak için bir araç vermektir.
Aşağıdaki protokol kayıt ve mikro-elektrod nöron ağları uyarıcı, kültür bizim laboratuar deneyimi 10 yılı aşkın temsil eder. Her adım, uzun, sağlıklı bir nöron ağları hayatta kalma gelişimine neden olarak optimize edilmiştir. Bazı iyi ayarları deneysel olarak belirlenmiş yerlerde kullanılabilir Referanslar sağlanmaktadır. Protokol başlamadan önce, cihaz ve malzemeleri almak ve başlıklı bölümde listelenen çözümler hazırlıyoruz 'Malzeme' 'Beyin Diseksiyon' bölümünde kısaca tartışıldı, ancak diğer görüntülenmiştir Deney makaleler Dergisi olarak bu konu kapağı 11 beraberindeki video gösterilmiştir olacaktır.
B. Beyin Diseksiyon
- Tüm beyinler embriyonik gün 18 (E18) sıçanlarda ayıklanır. Zamanlı gebe dişi sıçanlara inhale izofluran ve dekapite anestezi. Embriyolar, Ulusal Araştırma Konseyi Guid göre kaldırılır ve dissekeEmory Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmış bir protokol kullanarak laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için e.
- Aseptik teknik kullanılarak, embriyonik beyinleri kaldırılır ve 100 mm steril Petri kabı soğuk Hank Dengeli Tuzlar solüsyonu (HBSS) yerleştirilir. Diseksiyonu protokol kalan kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir laminer akış kaputu bir diseksiyon mikroskobu altında oluşur.
- Sıçan beyinlerinde diseksiyon için HBSS ile ikinci bir steril Petri kabı, bir seferde bir transfer edilir. HBSS batmış olsa da, beyin sapı, talamus ve serebellum kesip ve hemisferlerin örtülmüş.
- Olfaktör tüberkül meninksler yavaşça çıkarırken yarımkürede güvenliğini sağlamak için bir tanıtıcı olarak kullanılmaktadır.
- Sonra korteks, genellikle birden fazla embriyoların olduğu için altta yatan hipokampus, striatum uzak soyulmuş ve buz üzerinde hibernate çözüm steril 15 ml konik tüp saklanan 12, bu yordamı sonra kaplı olması istenen sayıda ÇÇA bağlı olarak tekrarlanan ve istenilen hücre yoğunluğu. Aşağıda anlatıldığı gibi korteksleri hücre disosiasyon süreci için birleştirilmiştir. Korteksleri 4 saklanabilir ° C hücre canlılığı sadece kaybıyla 24 saat önce disosiasyon kadar uyku çözüm. In-house disseke doku kullanan bir alternatif olarak, beyin dokusu disseke, beyin Bit (satın alma olabilir www.brainbitsllc.com) .
C. MEA hazırlanması ve kortikal disosiasyon
- ALA Bilimsel (ÇÇA elde edilir www.alascience.com ), üretici, Multi-Channel Sistemleri için bir satıcı. Elektrot yönelim ve boşluklar, varlığı ya da yokluğu bir dahili topraklama elektrot, varlığı ya da yokluğu bir cam yüzük ve cam halka boyutu farklılıklar ÇÇA birkaç farklı konfigürasyonları vardır. Bizim temel deneyler için, biz, 8 ızgara düzenleme ile küçük bir cam yüzük, 8, 60 elektrot içeren standart mikro-elektrot dizisi kullanın. Titanyum nitrür elektrot çapı 30 mikron ve elektrot merkezleri arasındaki mesafe 200 mm. Elektrotlar biri büyük ve işlevleri zemin veya dahili referans elektrot olarak. ÇÇA tutarken, bu elektrotlar zarar verebilir gibi katı cisimler (örneğin, pipet uçları, kağıt mendil ya da kauçuk polis), bugüne kadar yemeğin içinde dokunmatik hayati önem taşımaktadır. MEA kullanım kılavuzu (ÇÇA ve taşıma hakkında daha ayrıntılı bilgi bulunabilir www.multichannelsystems.com / products-mea / mikroelektrot-arrays.html ).
- Hücre hazırlama önceki akşam, ÇÇA de-iyonize su ile durulanır ve ardından 15 dakika boyunca% 70 etanol emmek için izin. Yemekleri daha sonra UV ışığı ile gece boyunca bir laminer akış kaputu yerleştirilir. Taşıma amaçları için, her MEA Petri kabı yerleştirilir tarih ve etiketleme ile standart bir 100 mm steril polistiren Petri kabı yerleştirilir. Notu, otoklav ve 90 su kullanarak da dahil olmak üzere diğer sterilizasyon teknikleri ° C MEA kullanım kılavuzu belirtilmiştir. Ancak, ampirik otoklav bir MEA kullanılabilir olması kez sayısını azaltmak gibi görünüyor bulduk. Şu anda kültürleri var ÇÇA yeniden iseniz, daha sonra organik madde kaldırılması gerekir. PBS içinde% 0.25 tripsin 300-400 ul MEA 35-37 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. MEA de-iyonize su ile durulanır ve ardından bir ışık mikroskobu ile denetlenir. Hücresel meselesi hala devam ederse, daha sonra tripsin adım temiz kadar tekrarlanır. Çanak temiz ise, o zaman yukarıdaki gibi sterilizasyon adım ile devam edin. Genel olarak, ÇÇA uygun bakım ile birden çok kez tekrar edilebilir.
- Ayrıca kaplama öncesi akşamı, MEA kapakları hazırlanmış ve otoklavlanırlar. Kapakları özel olarak tasarlanmış olup, aynı zamanda ALA-Bilimsel satın alınabilir. Politetrafloroetilen Teflon yapılmış ve net bir membran (florlu etilen-propilen Teflon) üst yayılmış vardır. Membran gazlarının yayılmasını sağlar ama neredeyse nemlendirilmiş bir atmosfer için ihtiyacı ortadan kalkmakta ve buharlaşma ve hyperosmolarity zararlı etkileri önlemek, böylece su difüzyon limitleri 1
- Yukarıdaki diseksiyon tamamlandıktan sonra, her MEA merkezi haline polietilenimin (PEI) çözümü 100 ul koyarak MEA hazırlık devam etmektedir. Ellerde 13 polylysine kullanmaktan daha MEA hücreler daha az kümeleme, PEI çözüm sağlar. Çanak, oda sıcaklığında 30 dakika hafifçe buharlaşmasını önlemek için ÇÇA üzerinde duran kapaklı laminer akış kaputu oturmak için izin verilir. Bir hatırlatma olarak, herhangi bir iş, açık MEA ya da beyin dokusu ile mini bir standart hücre kültürü laminer akış kaputu yer almalıdırkontaminasyon riskini en aza inmesi.
- MEA, daha sonra 3 kez 1-2 ml steril de-iyonize su ile durulanır. Ideal laminer akış kaput set-up yemeklerinden sıvı kaldırmak için bir aspiratör aparatı içerecektir. 200μl steril pipet ucu aspiratör tüp takılabilir. Bu elektrotlar zarar verebilir olarak aspire MEA yüzeyine dokunmayın. Sonra, son durulama MEA laminer akış kaputu en az 30 dakika kuruması için izin verilir.
- Korteks papain çözüm 2 ml, 15 ml steril konik plastik şişe içine koyarak bu kuruma süresi boyunca, nöronal disosiasyon süreci başlatıldı. DNAz 1 50 ul karışıma eklenir . Flakon 35-37 ° C'de su banyosu içine yerleştirilir ve yaklaşık 20 dakika inkübe edilir. Yavaşça çözüm kabarcıkları tanıtan önlemek için dikkatli olmak karıştırma için her 5 dakikada bir dokunun. Korteks sindirim ilerledikçe bulanık bir görünüm almaya başlamalıdır.
- Papain çözümü sonra dikkatlice 15ml konik flakon korteks bırakarak pipetleme kaldırılır. Hücre orta 2 ml, korteks 2-3 dakika boyunca inkübe izin ve yavaşça kaldırılır. Bu aynı zamanda orta serum tarafından inhibe olacak herhangi bir kalıntı papain, yıkayın. Başka bir hücre orta 2ml korteks eklenir ve bu örnek, 5-10 saniye sonra yüksek hız üzerine vortekslenmiş. 15ml konik flakonun alt bulutlu bir çözüm ve hiçbir kalan beyin parçaları olmamalıdır. Alternatif olarak, orta 3 kez 1 ml öğütme bir P-1000, elle tutulan ve pipet kullanarak doku dissociating için kullanılabilir. 1 uygun öğütme için, her pipet inme bir saniye almalıdır.
- Bu çözüm daha sonra hafifçe üzeri steril ağırlık 40μm hücre süzgecinden geçmek için izin verilir. P-1000 ile yavaşça süzgeç içine bir defada hücre çözümü bir damla ekleyin. A 35 mm steril Petri kabı gergin hücre çözümü toplamak için kullanılmaktadır.
- Hücre süspansiyonu daha sonra 15 ml konik flakon transfer edilir ve hücre orta son hacmi 4.0 ml eklenir. 14
- 500% 5 w / v BSA çözüm ul sonra P-1000 ile dikkatlice 15ml konik flakon dibine katmanlı 14 Bu flakon hücre içeren çözüm yukarı ettirilir.
- Alt BSA katmanlı hücre çözümü daha sonra küçük bir enkaz ve potansiyel olarak toksik hücre içi içeriğini kaldırmak için 200 xg'de 6 dakika santrifüj edilir . 14
- Hücre santrifüj basamağı sırasında, ÇÇA görsel tamamen kuru olduğundan emin olmak için değerlendirilir. Laminin çözüm 20 ul sonra dikkatle elektrotlar kaplıdır sağlamak MEA merkezi haline yerleştirilir 1 elektrot yüzeyi yetersiz hazırlık yol açabilir bu yana bu çözüm içine hava kabarcıkları tanıtan kaçının. MEA tamamen kuru değilse, o zaman damla laminin potansiyel kaplama daha zor elektrotlar üzerinde hücreleri yeterince yerelleştirmek çanak çapında yayılacak. Bu adım çok hassas ve kararsız bir eli ile MEA yol yüzeyine zarar veya dikkat hızlandırılmış potansiyele sahiptir.
- Teflon kapakları laminin buharlaşmasını önlemek için, bu noktada MEA üzerine yerleştirilir. Kapağın yerleştirilmesi de hassastır. MEA tamamen düz bir yüzey üzerinde bir kapak yerleştirilir veya kaldırılmış olmalıdır. Aksi takdirde, pürüzlü bir yüzey tarafından uygulanan ekstra güçleri kullanılmaz hale getirmekteydi dizi cam alt çatlayabilir. Çanak 20 dakika sonra kuvöz içine yerleştirilir.
- Laminin çanak bağlayıcı iken, hücreleri içeren 15 ml konik flakon santrifüj kaldırılır ve laminer akış kaputu geri transfer. Pelet flakonun alt görünür olmalıdır. Süpernatant steril bir 5ml plastik serolojik pipet yardımıyla dikkatlice çıkarılır. Santrifüj işlemi tamamlanmamış durumda süpernatantı kaydedin. Pelet sonra P-1000 veya hücre orta beklenen verimi bağlı olarak 300-500 ul hızlı bir vorteks öğütme nazikçe ya yeniden süspanse. Hücre süspansiyonu 10 ul kaldırılır ve hücre konsantrasyonunu belirlemek için bir hemasitometre yerleştirilir. Verim düşükse, santrifüj adım eksik olup olmadığını belirlemek için mikroskop altında süpernatantı analiz. Tekrar santrifüj gerekli olabilir. Verimi yüksek ise, o zaman bir seyreltme daha doğru sayma için gerekli olabilir. Hücre kaplama yoğunluğu 5.000 MEA ortalama 300.000 hücre aralığı. Istenilen sayıda kaplama için hücre 15-20 ul nihai hacmi böylece bir seyreltme hesaplayın. Biz genellikle ul başına 1000 ile 3000 hücreleri nihai bir konsantrasyon kullanın. Bir çift korteksleri genellikle 10 ila 15 milyon hücre verecektir. Öğütme kullanıldığında ise bu sayı biraz daha düşük olabilir.
- Bu süre, tMEA kuluçka tamamlanmış olmalıdır laminin. MEA Teflon kapağı çıkarılır ve laminin damla vakum aspire veya uzakta pipetlenir. Sonra istenilen hücre süspansiyonu 15-20 ul hemen laminin kalan ıslak alan üzerine pipetlenir. Bu küçük hacimli hücre süspansiyonu içine hava kabarcıkları, hava kabarcıkları eşit elektrot kapsayan hücreleri önleyebilir almaktan kaçınması için dikkatli olun. Kapak hafifçe değiştirilir ve MEA, 30 dakika boyunca özenle inkübatör geri yerleştirilir. Çanak sonra hücrelerin yapıştırılacağı sahip olmasını sağlamak ve tüm elektrotların karşılamak için ışık mikroskop altında incelenir. Elektrotlar kapsamında değilse, o zaman daha fazla hücre eklenebilir ve MEA bu yeni hücreler bağlı izin kapaklı inkübatör geri alınır. Hücre süspansiyonu bir tüp rahatsız oturduktan sonra birkaç dakika daha fazla kullanılması durumunda, hafifçe girdap yerleşmiş hücreleri tekrar süspansiyon emin olun. Bir kez yeterli elektrot kapsama sonra yemeğin yavaş, ılık 1ml (35-37 ° C) hücre orta su basması ile elde edilir. Teflon kapağının değiştirilmesi ve çanak inkübatör geri yerleştirilir. Laminer akış kaputu hızlı, bu yüzden onları teflon kapaklı kapalı tutmak için özen bir kez MEA küçük laminin hacimleri ve hücre süspansiyonu hacimleri kuru olabilir. Mühürlü ÇÇA için ideal inkübatör ortamında 5% 35-37 az CO 2, O 2% 9 ve% 65 nem ° C Düşük oksijen basıncı, oksidatif hasarı azaltmak için, uzun vadeli kültürler için önemli. 12 bakımı% 65 nem, buharlaşma, teflon zarından azaltır (herhangi bir nem kontrolü ile karşılaştırıldığında) ve su yoğuşması zarar vermeden MEA elektronik inkübatör kullanılmasına izin verir (as doygunluk nemlendirilmiş normal bir inkübatör).
D. hücre orta değiştirme ve ÇÇA ayrışmış kültürler bakımı
- Hücre kaplama bir gün sonra, ışık mikroskobu altında MEA inceleyin. Orta renk kırmızı renkte hala şeftali ve hücresel enkaz ve hücre ölümüne sınırlı bir miktarı vardır, sonra başka bir gün için ilk ve orta değişikliği gecikebilir. Ancak orta daha turuncu veya sarı renk ve / görünmeye başlıyor veya hücresel enkaz ve hücre ölümü büyük miktarda varsa, daha sonra orta değiştirmek. Tüm orta değişiklikler, standart bir hücre kültürü laminer akış kaputu meydana gerekir.
- MEA kapağı kaldırarak, çanak orta uzak aspire, taze hücre orta kaldırılan miktar değiştirerek, daha sonra kapak yerine ilk ve orta değişim oluşur. Kaplama işlemi kalan hücresel enkaz kaldırmak için ilk orta değişikliği hücre orta miktarın tamamını değiştirin. Müteakip orta değişiklikler sadece taze orta kaldırılan miktar değiştirerek, orta uzaklıkta yaklaşık yarısı aspire gerekir. Bu daha optimal bir yetiştirme ortamı sürdürmek hücreleri kalır hücre ortama salgılanan bazı büyüme faktörleri sağlar. Kapağın alt orta değiştirme işlemi sırasında kontamine olmuş veya kapak hasar veya gevşek belirtileri gösterirse, o zaman yeni bir otoklavlanmış kapak yararlanmak ise. Hücre orta özel bir modifiye kapaklı steril bir konteyner (gaz değişimi için izin veren bir teflon (etilen-propilen florlu) membran) inkübatör saklanabilir. Hücre orta ayrıca 4 saklanabilir ° C ama sıcak ve değişen orta önce inkübatör bu dengeye.
- Çıkarın ve yaklaşık yarısı haftada iki kez hakkında bir tabak orta yerine. Bazı hücre hazırlıkları daha sık değişiklikler için bir ihtiyaç neden ortamda daha hızlı renk değişiklikleri neden olabilir. Orta sarı not edilir, daha sonra tüm orta miktarı değişir. Sarı hızlı geçiş kontaminasyon işareti de olabilir, bu yüzden görsel enfeksiyon belirtileri için ışık mikroskobu altında çanak incelemek.
- , Deney koşullarına ve steril teknik bağlı olarak dikkatle bakılan kültürleri bir yıldan fazla yaşarlar. 1
ÇÇA gelen E. Kaydı
- Her MEA, 59 kayıt elektrotlar ve bir iç toprak elektrot vardır. Çeşitli ticari kayıt sistemleri gibi özel versiyonları vardır. Bayiler Multi-Channel Sistemleri, Tucker Davis Teknolojileri, Axion Biosystems, Alpha Med Bilimsel MED64, Plexon, Ayanda Biosystems ve biyolojik içerir. Laboratuvarımız şu anda bir ticari Multi-Channel Sistemleri kurulum, Windows tabanlı bir sistemi NeuroRighter 15 adı verilen özel bir, ve özel tasarlanmış bir Linux tabanlı sistem MeaBench 16 olarak adlandırılan kullanır. Bu sistemlerin her biri bir Multi-Channel Sistemleri preamplifikatör kullanarak ÇÇA (Multi-Channel Sistemleri) kayıt yapabiliyor. Tucker Davis Teknolojileri ticari bir kurulum da kullanılıyor. Bu protokol ile ÇÇA NeuroRighter kayıt gösterecektir. NeuroRighter yazılım, açık kaynak kodlu ve NeuroRighter Google gruplar üzerinde donanım tasarımları ile birlikte ücretsiz indirmek için kullanılabilir. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
- ÇÇA Kültürler faaliyet kararlı bir duruma ulaşması için 2-3 hafta sürebilir. 17,18 Bu etkinlik (bir kültür karşısında synaptically yayılır aksiyon potansiyelleri bir baraj) patlama spontan aksiyon potansiyelleri ve kültür-geniş içerir. Ancak deney doğa ideal Kayıttan önce in vitro gün sayısını belirlemek.
- Nöronal aktivite sıcaklık ve pH de dahil olmak üzere ideal çevre koşullarına bağlı olarak 1 Sonuç olarak, yukarıda açıklandığı gibi bizim kayıt inkübatör yer alır. Eğer kısa deneyler tasarlanmıştır (<30 dakika), ideal MEA sıcaklığı korumak için MCS preamplifikatör bağlı bir piyasada mevcut ısıtma modülü de vardır.
- Kaydı başlatmak için, MEA (hala onun Petri kabındaki) hafifçe depolama inkübatör kayıt inkübatör aktarılır. Yere çanak paralel altında tutun. MEA veya sarsma MEA ile bu yüzey kültür ayırmak gibi hızlı hareketler yapmaktan kaçının. MEA sonra Petri kabı kaldırılır ve kayıt preamplifikatör yerleştirilir. Maç şu anda toprak elektrot preamplifikatör (MCS preamplifikatör kanal CR15) ile gösteriyorlar yemekler iç toprak elektrot. Çubukla iyi bir bağlantı engel parmak izi veya diğer çöküntüleri uzaklaştırmak için% 70 etanol ile nemlendirilmiş bir doku ya da pamuk kullanarak MEA çevresinde kişileri silin. MEA doğru oturduğundan emin olduktan sonra, preamplifikatörün kapağı sonra indirilir ve yerine oturana kapatılmamıştır. Preamplifikatör kapak kişileri MEA elektrot temas pedleri sıkıca dayanmalıdır. Görme iletişim hizalamayı kontrol edin ve gerekirse pamuklu bir bez ile ayarlayın. Inkübatör Peltier aygıtına preamp yerleştirin. Bu iki bakır plakalar arasında sıkışmış bir Peltier termoelektrik ısı pompası ile oluşur. Bazı preamp devresi tarafından üretilen ısı kaldırmak için 5V hakkında bu çalıştırın. Bu teflon membran kapak içinde oluşan yoğuşma. Herhangi bir yoğunlaşma, buharlaşma nedeniyle hücreleri ile temas, orta ozmolarite artış kültür zarar işaret eder. Bu preamp ve orta inkübatör hava sıcaklığı altında bir ya da iki derece sağlayarak, ozmolarite değişiklikleri minimize edilmiştir.
- NeuroRighter için güç kaynağı açın ve iş istasyonu yazılımı açın. Da yer uygun yazılım / donanım yapılandırmaları ile in vitro NeuroRighter ayarlarını yapın. Yazılım elektrot sayısını seçin. Arka plan gürültüsünün miktarını azaltmak için, dijital bir band geçiren filtre etkin olabilir. Daha sonra analiz için veri kaydedilmiş ise kayıt anahtarı ile bir veri dosyasını seçin. Tüm uygun ayarları seçilir sonra start düğmesine etkinleştirin.
- Ekran aktivite ve arka plan gürültü izleri göstermesi gerekir. Ara sıra aksiyon potansiyelleri ve geniş patlamaları faaliyet çanak görünür olmalıdır. ÇÇA sorun giderme kayıt Aşağıdaki bölümde, beklenen aktivite görüntülenmiştir değilse birkaç ortak sorunları tartışmak.
- Ekran görünümü 3ms zaman meydana gelen aksiyon potansiyelleri statik görüntülenir başak algılama modu (Hoparlör Wfms 'sekmesini) değiştirilebilir. Belirli bir kanal için, gerçek ekstrasellüler aksiyon potansiyelleri yaklaşık 1ms sürmelidir ve aynı yönde (pozitif veya negatif) art arda ateş gerektiğini. Bazen, iki veya daha fazla nöron farklı kutuplarla aynı elektrot görünür olabilir. Kısa bir süre ders ve değişken polarite Spike muhtemeldir artifakı. Şekil 1 başak veri raster çizim gösterir.
- Ekran görünümü faaliyet patlama kökeni lokalize bir görünüm için, yerel alan potansiyelleri (LFPs) değiştirilebilir. Bu tür ayar tek tabaka kültürleri zayıf LFPs beri in vivo olarak kayıt yaparken daha yararlı olabilir. Unutmayın ki, bazı preamplisi (Multi-Channel Sistemleri kullanmak dahil), düşük frekans LFP ritimleri azaltacaktır 10 Hz yüksek geçiren filtreler var.
F. ÇÇA üzerinde uyarıcı nöral ağların
- MEA üzerinde aynı 59 kayıt elektrotları da kültürünü teşvik etmek için kullanılabilir. Deney doğa stimülasyon ölçüde belirleyecektir. Açık kaynak kodlu olduğundan NeuroRighter stimülasyon deneysel tasarım için esneklik sağlar. 15
- Bir kültür uyarıcı karşı uyaran birkaç milisaniye son bir artifakı oluşturur. Bu yapıyı başak algılama ve belirsiz uyaran tepkileri tetiklemek için yeterince büyük olabilir. NeuroRighter uyaran artifakı en aza indirilmesi ve bazı durumlarda aslında ortadan kaldırmak için Salpa algoritması kullanır. 19
- MEA nöronal ağ teşvik etmek, uyarılması artifakı sınırlamak için 'Kayıt ayarları' sekmesi altında Salpa algoritması tren. 'Online Ayarları' sekmesinde Salpa etkinleştirin. Bir dosya adı seçin ve Kayda başlamak için, daha önce Başlat düğmesini tıklatın. Sonra 'Stim' sekmesini tıklatın. Bu sayfada stimülasyon kurmak için birçok seçenek vardır.
- Basit bir deney, bir elektrot teşvik etmek ve 'Open loop' bölümünü kullanarak çanağı yanıt izlemek için. Hızı, gerilim, faz genişliği ve kanal numarası seçin. Açık döngü bölümünde start düğmesine basın. Bu uyarının Responses ana 'Spike' sekmesini seçin ve 'Hoparlör Wfms' sekmesini görüntülenebilmekte ve veri dosyaları analiz edebilirsiniz.
- Gerçek zamanlı olarak, patlamaları, birden fazla elektrot boyunca 0.5V bir hertz uyaran bir zaman kilitli bir şekilde görüntülenebilir. Şekil 2'de, bir raster çizim sonrası bir uyarana tepki gösterir. Geçmiş gözlemler uyaran-uyarılmış aktivitenin iki farklı türü olduğunu göstermiştir. Aksiyon potansiyelleri (dAPs) doğrudan uyarılmış ve synaptically uyarılmış aksiyon potansiyelleri (PBDÖ) 20
- Kültür Nöronlar faaliyet kendiliğinden patlamaları var. Bazı deneyler için ağ dinamikleri kontrol etmek için çalışırken, bu tür patlama engelleyebilir. İlginçtir ki, elektrot başına 1-2 Hz stimülasyon dağıtılan bir MEA bir nöronal ağ faaliyet patlama bastırmaya başlayabilirsiniz. 21
ÇÇA G. Sorun çekim kayıt
- Hiçbir aksiyon potansiyelleri yazılım açık MEA veya mevcut patlama:
- Kültür, yeteri kadar eski mi? Aksiyon potansiyelleri, in vitro olarak ilk hafta sonuna doğru görünür olmalıdır . Patlama in vitro 2-3 hafta etrafında oluşur.
- Donanım güç alıyor? NeuroRighter sistemi donanım güç için iki 6V kurşun-asit bataryalar kullanır. Güç düğmesi açık konuma ve şarjlı pil gerekir.
- Kültür hayatta mı? Bu zamanlarda özellikle yoğun veya daha büyük bir kültür çünkü glial hücre üremesine yol belirlemek zor olabilir. Ancak, sağlıklı görünen nöron (faz kontrast mikroskobu altında parlak, eliptik şekilli hücre gövdeleri) ve sağlam (parçalanmış) hücre süreçlerini bakabilirsiniz. Görünür kirlenme veya aşağılayıcı orta hızla (orta değişiklikler arasında sadece 1-2 gün sonra asidik hale) için kanıt varsa da kültürü ile ilgili bir sorun olabilir.
- Elektrot empedansı nedir? Birden fazla kullanır içinde, mikro elektrotlar veya bir MEA yalıtım düşürebilir. NeuroRighter elektrot empedansı değerlendirmek için kabiliyetine sahiptir. 1kHz yaklaşık 15 Normal empedans okuma, 10.000 ve 100.000 Ohm arasında olmalıdır . Yüksek empedanslar 10.000 'den az Ohm sızdıran izolasyon öneririz kırık açar veya elektrotlar ve okumalar öneririz.
- Preamplifikatör donanım kuruluna bağlı mı? Preamplifikatör donanım kartı birbirine bağlayan bir çıkış kablosu olmalıdır. Preamplifikatör de temel donanım kurulu bağlamak ve sadece uyarılması için önemli olan 4 küçük stimülatörü kurulları vardır.
- NeuroRighter yazılım ayarları değişti mi? Işe kaydetmek için yazılım donanım yapılandırması ayarları doğru olmalıdır. Güncelleştirilmiş sürümlerini yükleme ve çoklu kullanıcılar değişen ayarları buna neden olabilir.
- MEA 35-37 ° C? Soğutucu sıcaklıklarda kortikal ağlarda spontan aktivitede bir azalma neden olabilir. MEA, birkaç saniye daha kuvöz dışında olması durumunda kayıt iklim kontrollü inkübatör içinde oluşur Bu genellikle bir sorun değildir, ancak bir sıcaklık dengelenmesi için izin vermelidir.
- Geçtiğimiz birkaç saat içinde Orta değişmiştir? Biz kültürlerin genellikle beslenmeden sonra birkaç saat süreyle ateş durdurmak gözlemledik. Bu nedenle, beslemeden önce deneyler için en iyisidir.
- Aşırı arka plan gürültü doyurarak kayıt penceresi Elektrot:
- Preamplifikatör pin MEA yeterli bir elektrot ile temas var mı? Bu sorun, bir yanlış hizalanmış pin preamplifikatör kapağı, küçük bir parça çöp, bir damla orta, bozulmuş bir elektrot yüzeyi ya da kapağın üst üste net bir membran neden olabilir. , Bu sorunlar için kişi teftiş ilk adımdır. Uzakta temizlenmesi için orta bir damla vardı, özellikle% 70 etanol içinde batırılmış bir pamuklu çubukla pin ayarlanması bazen temas artırabilirsiniz. Sinyal etanol buharlaşır kadar kötü görünebilir. </ P>
- Elektrot zarar görünüyor mu? Işık mikroskobu altında Görselleştirme bazen çatlak veya çekirdeksiz artifakı bu tip önde gelen elektrot yalıtım ortaya çıkarabilir.
- Aşınmış veya çizilmiş irtibat pedler musunuz? Bazen optimize etmek zor MEA birkaç elektrot temas olabilir. Bu birden fazla MEA kullanır ve kaplamalar sonra daha sık görülür. Altın tel emdirilmiş kauçuk ayırıcı, 0.5mm kalınlığı yönünde yapar ve MEA ile preamplifikatör pin temas artırabilirsiniz. Bu malzeme Fujipoly edinilebilir ve MEA ve kapak sığdırmak için sevimli olabilir.
- Tüm MEA, aşırı arka plan gürültü gösterir:
- MEA toprak elektrot preamplifikatör zemin pin temas etmesine izin şekilde, doğru yönde MEA mi? MEA doğru yönde ise, o zaman hiçbir yere temas sorunları (2 ac üzeri) vardır sağlanması da göz önünde bulundurmak önemlidir. Kanal CR15 preamp şasi kısa bir tel ile topraklı mı? Dahili 30 kOhm dirençleri üzerinden yere jumper kullanma, aşırı gürültü neden olabilir.
- Çevreleyen farları, güç kaynakları veya diğer ekipman parçaları girişim var mı? Girişim en yaygın biçimlerinden biri ışıkları ve ekipmanları ile 60 Hz. Kayıt sistemi düzgün topraklanmış olmalıdır. Ekranlama maruz kablolar da arka plan girişim azaltarak yararlı olabilir.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: Bu nöronal bir ağ spontan aktivite 2 dakikalık bir raster arsa. Her siyah bir nokta, bir aksiyon potansiyeli temsil eder. Aktivite patlamaları mavi oklarla gösterilir. Birden fazla elektrot üzerinden yanıt ağ bağlantısı bir fonksiyonudur.
Şekil 2 uyaran-uyarılmış aktivitenin 16 saniyede bir raster komplodur. Kırmızı yıldızlar uyaranlara temsil eder. Kırmızı oklar, başarılı bir şekilde birden fazla elektrot arasındaki sinaptik aktivite patlamaları indüklenen beş uyaranlara göstermektedir. Bazen, bir uyarıcı, mavi ok, bir patlama verim değildir.
Discussion
Bu protokol, kültürü ile ilgili talimatlar gösterir ve nöron ağlarının yanı sıra mikro-elektrod kayıt ve nöron ağları uyarıcı bir giriş korumak. ÇÇA kayıt daha yaygın sorunlardan bazıları da MEA sorun giderme bölümünde ele alındı. Boyunca tartışılmış ve çoğu zaman bu değişiklikler bazı deneysel tasarımları gerektirdiği özel koşullar optimize etmek için kullanıldığı gibi, protokolde zaman zaman farklılıklar vardır.
Burada sunulan kayıt ve MCS preamp NeuroRighter 15 tasarlanmış özel oluşan uyarıcı sistem olmasına karşın, birden fazla nöron ağları ile bir arayüz sağlayabilir diğer sistemler vardır. Belirli bir kurulum seçimi spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olacaktır.
Ancak bu kültürlerin ÇÇA üzerinde basit bir kayıt ve stimülasyon örnekleri sinaptik aktivite ve nöronal ağ bağlantısı ile ilgili karmaşık sorular içgörü sağlamak için kullanılabilir, bu protokolde verilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, devam eden çalışmaları hücresel plastisite gibi süreçleri incelemek için bu teknolojiyi kullanan, geliştirme, eksitotoksisitesi ve nörodejenerasyon 6-10 Örneğin, bizim laboratuvarda yeni bir yayın tekrarlanabilir hedefe, gerçek zamanlı kapalı döngü stimülasyonu ile in vitro öğrenme yönetti gösterdi nöronal ağ etkinliği 3 yanıt.
MEA kültürler genellikle finicky ve hassas olmasına rağmen, basitlik ve erişilebilirlik (sağlam hayvanlara kıyasla) sayesinde, bir ağ düzeyinde nöronal aktivitenin çalışmak için güçlü bir model sağlar.
Disclosures
CMH ifşa etmek için hiçbir ilgisi yoktur.
Acknowledgments
Biz protokol sağlamak için paha biçilmez bir yorum Potter grup üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Amerikan Nöroloji Vakfı Akademisi CMH klinik araştırma eğitim bursu, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS bir burs tarafından finanse edildi http://www.nigms.nih.gov/ JDR (GM08169) ), NIH Ulusal Nörolojik Hastalıklar Enstitüsü ve hibe Stroke (NS054809), JDR için bir Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (NS060392), bir NSF EFRI hibe (0.836.017), Coulter Vakfı Translasyonel Araştırma Ödülü, ve JDR translasyonel araştırma bursu (NS007480).
Materials
Supplies
Equipment:
Solutions and Reagents: BSA solution: Cell Medium: Dissection solution for preparing papain solution:23
This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Hank’s balanced salt solution: Hibernate solution: Laminin solution: Papain solution:23 Polyethyleneimine (PEI) solution:13 Sterile de-ionized water: Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).
- Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).
- Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).
- Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks. Phys Biol. 4, 181-193 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).
- Hofmann, F., Bading, H. Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration. J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).
- Gortz, P. Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations. J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).
- Koito, H., Li, J. Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies. J Vis Exp. 31, (2009).
- Brewer, G. J., Cotman, C. W. Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen. Brain Res. 494, 65-74 (1989).
- Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates. J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).
- Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy. Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).
- Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts. Front Neuroengineering. 2, (2009).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control. J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci. 7, (2006).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting. J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks. PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).
