Summary
في هذه المقالة ، وتبين لنا طريقة لجعل الإبر الزجاج الشعرية مع التجويف 50 ميكرومتر. هذا الأسلوب يقلل بشكل ملحوظ من تلف في الدماغ ويقلل من انتشار السلبية للمخدرات ويسمح باستهداف دقيق في الدماغ القوارض.
Abstract
Microinjections في لحمة الدماغ هي الاجراءات الهامة لتسليم المخدرات ، وناقلات فيروسية أو زرع الخلايا. آفة الدماغ التي تنتج إبرة حقن خلال مساره هو مصدر قلق كبير خصوصا في مخ الفأر ليست فقط في الدماغ هو صغير ولكن أيضا في بعض الأحيان هناك حاجة لحقن متعددة. نعرض هنا طريقة لإنتاج الزجاج الإبر الشعرية مع التجويف 50 ميكرون مما يقلل بشكل كبير من تلف في الدماغ ويسمح لاستهداف دقيقة في الدماغ القوارض. هذا الأسلوب يسمح للتسليم كميات صغيرة (2-10 NL) ، ويقلل من مخاطر النزيف ، ويقلل من انتشار المخدرات السلبي في لحمة الدماغ. باستخدام مختلفة الحجم من أنابيب الزجاج الشعرية ، أو تغيير تجويف الإبرة ، يمكن حقنه عدة أنواع من المواد والخلايا. Microinjections مع أنبوب زجاجي الشعرية تمثل تحسنا كبيرا في تقنيات الحقن العميق للمخ واستهداف مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية في القوارض الصغيرة.
Protocol
- جعل الإبر الزجاج قبل الجراحة الماوس :
- وضع أنبوب زجاجي الشعرية في مجتذب micropipette.
- الحرارة منتصف أنبوب زجاجي لتليين أنبوب زجاجي في منطقة المترجمة.
- تمديد أنبوب زجاجي على طول محورها الطولي من قبل مسافة كافية للتسبب الأولية انخفاضا في قطر أنبوب زجاجي في منطقة المترجمة.
- إبقاء تمتد أنبوب زجاجي حتى ينكسر. بهذه الطريقة ، يتم الحصول على متطابقتين الإبر واحد للبرميل.
- وضع الإبرة الزجاج في microforge. زاوية 30 درجة تكفي لشطبة غيض.
- الاختيار تحت المجهر أن كل إبرة والقطر الداخلي الصحيح. بالنسبة لمعظم العقاقير ماء قطرها ميكرون 30-50 الداخلية مثالية (الشكل 1).
- تملأ الإبرة مع الزيوت المعدنية من أوسع نهاية الإبرة الزجاج. اسمحوا ان الزيوت المعدنية (MSDS ، القط. M7700) يدخل من الشعرية حتى تصل ~ 50 ٪ من طول الأنبوب الشعرية. وضعت عالية فراغ الشحوم (داو كورننغ ، القط. AB - 05054) حول المكبس لختم أوسع نهاية الإبرة.
- إدراج بواسطة المكبس أوسع نهاية الإبرة المعدنية ودفع النفط برفق حتى ينظر إلى قطرة صغيرة من زيت الخروج من رأس الإبرة الزجاج.
- تأمين الزجاج في إبرة صاحب microinjector.
- تخدير الفأر مع آفيرتين 2.5 ٪ (2،2،2 - ثلاثي بروم إيثانول + كحول أميلي ثالثي ، 01:01 ث / ت). جرعة من 25 غرام 30μL في داخل الصفاق.
- وضع وسادة التدفئة على الجهاز للحفاظ على درجة حرارة المجسم الحيوان الجسم عند 37 درجة مئوية.
- مكان آمن ورئيس جهاز الماوس في المجسم باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
- تنظيف رأس الفأر مع 0.1 ٪ كلورهكسيدين غلوكونات الحل ، تليها الايثانول 70 ٪ و 0.1 ٪ جلوكونات الكلورهيكسيدين للمرة الثانية.
- شق الجلد مع شفرة جراحية # 15 من آذان الفأر إلى خط الجمجمة لامبا.
- تلميع الجمجمة مع القطن المبادلة لتجف بها وسحب الجلد خارج الحقل الجراحية.
- استخدام غيض من الزجاج لإبرة نقطة في قمة الرأس للخياطة Bregma. يوجد لديك لضبط الموقف المبدئي من حاقن (في تنسيق "صفر").
- تعيين نقطة لحفر عن طريق تحريك "X" و "Y" محور الجهاز المجسم على الجمجمة.
- حفر ثقوب دقيقة جدا في التنسيق المحدد. وقد سبق تعقيم الأدوات المعدنية وMicrodrills أخرى عند 250 درجة مئوية لمدة 60 ثانية مع حبة تعقيم الزجاج الجافة (كول بالمر ، القط. EW - رقم 10779-00).
- ملقط مع غرامة إزالة بعناية أعمق طبقة من العظام وكسر الغشاء duramatter (سوف نرى بعض السائل الدماغي الشوكي تسرب).
- تأكد من أن الإبرة يمكن أن تذهب من خلال الثقوب المحفورة.
- 1 ميكرولتر ماصة للدواء الذي تريد حقن ووضعها على قطعة صغيرة من parafilm.
- وضع parafilm على الجمجمة.
- امتصاص الدواء من خلال الدوران على العجلات microinjector ، في حين كنت الاختيار تحت المجهر أن السائل هو الصعود إلى الإبرة الزجاج.
- إزالة parafilm وإعادة تعيين تنسيق صفر.
- تحرك الإبرة إلى إحداثيات المحدد ، أسفل حامل حتى غيض من الزجاج إبرة اللمس برفق على سطح الدماغ ، وتعيين "Z" تنسيق في صفر.
- إدخال الإبرة في الزجاج لحمة على عمق الدماغ المحدد.
- حقن الدواء ببطء بمعدل NL 1 ~ / ثانية.
- عندما يتم حقن حجم الرغبة ، والسماح للنشر المخدرات في لحمة لمدة 2 دقيقة. ثم الشروع في إزالة الإبرة بسلاسة وببطء.
- الصمغ على الجرح الجراحي وإزالة الحيوان من الجهاز المجسم ووضع الحيوانات في قفص قبل تحسنت تحتوي على سرير نظيف للانتعاش التخدير.
- لتوفير ما بعد الجراحة تلقى تسكين جميع الحيوانات 5 ملغ / كغ تحت الجلد Ketorolac كل ساعة 12 لمدة 24 ساعة.
ممثل النتائج :
عند اتباع هذا البروتوكول ، ويتم الحصول على حقن دقيقة جدا ومسار الإبرة ضيقة جدا تقلل من إصابات الدماغ. نتيجة ممثل هذا الأسلوب ، نحن حقن lysophosphatidyl الكولين (lysolecithin) في الجسم الثفني التي تنتج من إزالة الميالين مساحات المادة البيضاء 1-4. للحد من إصابات الدماغ التي تنتجها الإبرة الزجاج ، وحقن نحن فقط من 20 NL lysolecithin في الجسم الثفني ، ولكن يمكن حقن كميات أكبر إذا كان ذلك مطلوبا بقدر 200 NL مع نفس الأسلوب. تم الكشف عن إزالة الميالين بواسطة الغائب التعبير بروتين النخاعين الأساسي في مساحات المادة البيضاء (الشكل 2).
الشكل 1. إبرة الزجاجية التي يبلغ قطرها 50 ميكرومتر. المسافة قصيرة بين اثنين من القرادفي جدول يمثل طول 50 ميكرومتر.
حقن Lysolecithin الرقم 2. في الجسم الثفني. ويرد إزالة الميالين كتعبير المايلين لا البروتين الأساسي (منطقة منقط). لاحظ صغر حجم الجهاز إبرة الزجاج (الأسهم). بار = 100 ميكرومتر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأظهرت الأسلوب في هذا الفيديو هو مفيد جدا لتقديم معظم العقاقير أو ناقلات فيروسية في أماكن دقيقة جدا في الدماغ. بعض المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي موثوقية نقطة الاستهداف ، ودقة من الحقن وصغر حجم المخ ، والضرر الآفة المسالك 1 ، 2 ، 5 ، 6. يجب مرة واحدة موحدة هي تقنية نطاق mistargeting 50 ميكرون أو أقل 1 و 2. ويمكن أيضا أن يتم زرع الخلايا باستخدام أوسع ، 100-150 ميكرون 7-9 ، الإبر. يمكن أن تودع كفاءة الخلية في ذلك تسليم محددة للغاية الضرر الآفة الجانبية الناجمة عن التقليل من زرع الخلايا. هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا الأسلوب :
- كنا دائما ننصح خدش بهدوء الجمجمة مع إبرة الأنسولين لتسمية الإحداثيات المحددة قبل الحفر.
- إدخال الإبرة الزجاج مع حركة سريعة لاختراق السطح بسرعة الدماغ.
- حالما يتم التوصل إلى عمق الأمثل يجب عليك إدخال الإبرة 0.1 ملم في عمق الدماغ لحمة لجعل "القناة" التي تسمح بحرية المخدرات منتشر في الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد OG - P بواسطة CONACYT ق منحة (CB - 2008-101476) وFRABA (686/10). AQ - H بدعم من المعهد الوطني للصحة ، ومعهد هوارد هيوز الطبي ، ومؤسسة روبرت وود جونسون ومؤسسة الخلايا الجذعية ولاية ماريلاند.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary glass tube | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| Micropipette puller | Kopf Instruments | Model 730 | |
| Microforge | World Precision Instruments, Inc. | Model 48000 | |
| Mineral oil | MSDS | M7700 | |
| High-vacuum grease | Dow Corning | 05054-AB | |
| Anesthesia: 2.5% Avertin | 2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v | ||
| Heater pad | Mastex | Model 900 | |
| Stereotactic device | Kopf Instruments | Model Kopf-900 | |
| Surgical scalpel blade # 15 | Medi-Cut | ||
| Micro driller | Ideal Micro Drill | 67-1000 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | ||
| 1-μL Micropipette | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | Vasiorkop with Contraves system | |
| Microinjector | Narishige International | Model MO-10 |
References
- Menn, B. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).
- Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes. Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).
- Hall, S. M. Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline. J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).
- Webster, G. R., Thompson, R. H. Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues. Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain. Cell. 97, 1-20 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36, 1021-1034 (2002).
- Baraban, S. C. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).
- Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy. Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).
- Alvarez-Dolado, M. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).
