Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays
Summary
Dieser Artikel will in schrittweise beschreiben die gebräuchlichsten<em> In-vitro-</em> Tests in Studium Schwann-Zell-Interaktionen asrtocyte verwendet.
Abstract
Schwann-Zellen sind eine der häufigsten verwendete in Reparatur befindlichen Zellen Strategien nach Rückenmarksverletzungen. Schwann-Zellen sind in der Lage zu unterstützen axonale Regeneration und Sprossung durch Sekretion Wachstumsfaktoren 1,2 und Bereitstellung von wachstumsfördernden Adhäsionsmoleküle 3 und extrazelluläre Matrix Moleküle 4. Außerdem sind sie myelinisieren der demyelinisierte Axone an der Stelle der Verletzung 5.
Doch nach der Transplantation, tun Schwann-Zellen nicht von der Stelle des Implantats zu migrieren und nicht mit dem Host-Astrozyten 6,7 vermischen. Dies führt zur Bildung einer scharfen Grenze zwischen Schwann-Zellen und Astrozyten, wodurch ein Hindernis für den Anbau von Axonen versucht, das Transplantat wieder in das Wirtsgewebe proximal und distal zu verlassen. Astrozyten in Kontakt mit Schwann-Zellen auch zu unterziehen Hypertrophie und Up-Regulierung der hemmenden Moleküle 8-13.
In vitro-Untersuchungen haben zu modellieren Schwann-Zell-Interaktionen Astrozyten verwendet worden und wurden in das Verständnis des Mechanismus der zellulären Verhaltens wichtig.
Diese in-vitro-Assays gehören Grenze Assay, wo eine Co-Kultur unter Verwendung von zwei verschiedenen Zellen, die mit jedem Zelltyp zu besetzen verschiedene Gebiete mit nur ein kleiner Spalt zwischen den beiden Fronten Zelle ist. Da die Zellen teilen sich und wandern, bekommen die beiden zellulären Fronten einander näher und schließlich kollidieren. Dies ermöglicht dem Verhalten der beiden Zellpopulationen an der Grenze analysiert werden. Eine weitere Variante der gleichen Technik ist es, die beiden Zellpopulationen in der Kultur-Mix und im Laufe der Zeit die beiden Zelltypen mit Schwann-Zellen zu trennen verklumpten als Inseln zwischen Astrozyten zusammen Erstellen mehrerer Schwann-Astrozyten Grenzen.
Der zweite Test in der Untersuchung der Interaktion von zwei Zelltypen ist die Migration-Assay, wo zelluläre Bewegung auf der Oberfläche der anderen Zelltyp Monoschicht 14,15 verfolgt werden können. Dieser Test wird im Allgemeinen als umgekehrt Deckglas Test bekannt. Schwann-Zellen werden auf kleine Glassplitter kultiviert und sie sind Gesicht invertiert hinunter auf die Oberfläche der Astrozyten Monoschichten und Migration ist von der Kante des Deckglases beurteilt.
Beide Tests wurden bei der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der zellulären Ausgrenzung und Grenzen Bildung beteiligt instrumental. Einige der identifizierten Moleküle mit diesen Techniken gehören N-Cadherine 15, Chondroitinsulfat Proteoglykane (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Eph / Ephrine 19.
Dieser Artikel will Grenze Assay und Migration-Assay in schrittweise beschreiben und erläutern die möglichen technischen Probleme, die auftreten könnten.
Protocol
Discussion
Die oben beschriebenen Assays wurden in verschiedenen Studien, die die Rolle der verschiedenen Faktoren in Grenzen Bildung zwischen den Schwann-Astrozyten und begrenzt Schwann Zell-Migration in Astrozyten Umfeld eingebunden worden.
Das Verständnis der Mechanismen, die diese Ereignisse ist wichtig, da es erlauben würde, die Entwicklung von Strategien zur Optimierung und Verbesserung der Integration von Schwann-Zellen Transplantate nach der Transplantation und damit erleichtern Sie die Ausfa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Philippa Warren für ihre freundliche Hilfe danken.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | ||
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | ||
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | ||
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | ||
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | ||
| Coverlips | VWR-International | 631-0149 | ||
| Coverlips(rectangle) | MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) | BB022050A1 | ||
| Chamber slides | Nunc-LabTek | 177380 | ||
| 4 well plates, 6 well plates | Nunc | 4 well plates 6 well plates |
||
| rat p75 antibody | Millipore, Temecula,California | MAB365 | ||
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | ||
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 |
Goat anti mouse 568 Goat anti Rabbit 488 |
|
| Secondary biotinylated | Vector | Goat anti mouse | ||
| DAB tablets | Sigma-aldrich | D4418 | ||
| ABC elite kit | Vector | PK-6100 | ||
| Fine Forceps | FST | 11295-10 | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | ||
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
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