Summary
El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.
Abstract
El descubrimiento en 2006 de que los fibroblastos humanos y de ratón podría ser reprogramado para generar células iPS de 1-3 con cualidades muy similares a las células madre embrionarias ha creado una nueva y valiosa fuente de células pluripotentes para el descubrimiento de fármacos, la terapia celular y la investigación básica.
Los medios de comunicación GIBCO y reactivos han estado a la vanguardia de la investigación de células madre pluripotentes de años. Nocaut DMEM suplementado con suero de reemplazo golpe de gracia es el medio de elección para el crecimiento de células madre embrionarias, y ahora el cultivo de células iPS 3-9. Este estándar de oro del sistema de medios ahora se puede utilizar para alimentación libre de la cultura con la adición de cóctel golpe de gracia SR factor de crecimiento.
ES humanas tradicionales y los métodos de cultivo de células iPS requieren el uso de ratón o humano capas de fibroblastos de alimentación o el alimentador de medio condicionado. Estos métodos de cultivo son mano de obra, difícil de escalar y que es difícil mantener las células indiferenciadas caderas debido a las condiciones indefinido. Invitrogen ha desarrollado SR golpe de gracia crecimiento Cocktail factor que le permite fácilmente la transición de su cadera para cultivos de células de alimentación libre, manteniendo el uso de SR golpe de gracia.
Protocol
Nota: Para mantener condiciones estériles cultura, todos los procedimientos descritos en este protocolo se realiza mediante prácticas de laboratorio y estériles a cabo bajo una campana de flujo laminar.
Antes de comenzar, asegúrese de que cualquier medio es equilibrado a 37 ° C y adecuadamente el gas.
Preparación Geltrex recubierto placas de cultivo
Nota: véase el apéndice para el uso de platos de la cultura CELLstart recubierto
- Descongelar un tubo de Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 º C y se diluye 1:100 en 99 ml de golpe de gracia D-MEM/F-12. Mezcle la solución suavemente.
Nota: Algunas líneas de células iPS pueden requerir una dilución diferente Geltrex para un crecimiento óptimo. Véase el apéndice para las diluciones alternativa. - Cubrir toda la superficie de cada placa de cultivo con la solución Geltrex (1 ml por un plato de 35 mm, 1,5 ml de un plato de 60 mm).
- Sello de cada plato con Parafilm para evitar la sequedad y se incuban las placas durante 1 hora a 37 ° C.
Nota: En este punto usted puede almacenar las placas de cultivo Geltrex recubierto a 4 ° C durante un máximo de un mes. Sello de cada plato con Parafilm para evitar la Geltrex se seque. - Antes de usar, la transferencia de los platos Geltrex recubierto con una campana de flujo laminar y permitir que alcancen la temperatura ambiente (alrededor de 1 hora).
Preparación del alimentador de Libre Completo SR golpe de gracia Media
- Para preparar 1 ml de 10 mg / ml de solución FGF básico, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses.
FGF básico 10 mg D-PBS 990 l 10% de BSA 10 l
Nota: BSA se puede sustituir con HSA o SR golpe de gracia a la misma concentración. - Para preparar 50 ml de solución de 2 Dispasa mg / ml, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Filtro de esterilización de la solución y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
Dispasa 100 mg D-PBS 50 ml - Para preparar 100 mL de SR anulación completa del alimentador-Free (KSR-FF) medio asépticamente combinar los componentes que figuran en la tabla de abajo.
Puede almacenar el medio KSR-FF a 2-8 º C durante un máximo de una semana.Componente Concentración de la La concentración final Volumen Nocaut DMEM/F12 (cat. n °. 12660-012) - 1X 76.8 mL Glutamax-I (Cat. N º 35.050-061) 200 mM 2 mM 1 mL SR golpe de gracia (art. no. 10.828-028) - 20% 20 ml Golpe de gracia SR-GFC (cat. n °. A10580-01) 50 veces 1X 2 mL bFGF (Cat. no. PHG0024) 10 mg / ml 20 ng / mL 200 l - Justo antes de pre-equilibrar el medio completo a la temperatura y gases, añadir asépticamente el volumen requerido de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentración) para una concentración de 0,1 mM final. Por ejemplo, para preparar 100 ml de KSR-FF medio añadir 182 l de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 dilución) Por otra parte, el 2-mercaptoetanol puede ser añadido al medio 1X completaron y se almacenaron a 2-8 ° C para hasta una semana.
La adaptación a CMPi KSR-FF Medio
- Antes de comenzar, pre-equilibrar sus platos Geltrex revestido a temperatura ambiente en el capó.
- La cultura de la CMPi en células alimentadoras MEF hasta que el 70-80% confluente. Por favor, consulte el manual GIBCO de fibroblastos de ratón embrionario para los protocolos de la cultura basada en el MEF. Pre-caliente el volumen necesario de Dispasa en un baño de agua a 37 ° C. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Pre-equilibrar el volumen requerido de KSR-FF en un baño de agua 37 ° C for15 min. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Aspirar el medio de las placas de cultivo, y añadir una cantidad apropiada de solución Dispasa. Incubar las placas a 37 ° C durante 3-5 minutos.
- Aspirar la solución Dispasa de cada recipiente de cultivo y lavar las células alimentadoras MEF suavemente con D-PBS (2 a 3 veces).
- Añadir una cantidad apropiada de medio completo SR golpe de gracia a cada recipiente de cultivo. Use un raspador celular o una pipeta de 5 ml para raspar suavemente las células de la superficie del recipiente de cultivo.
Nota: véase el apéndice para los protocolos de adaptación alternativa para las líneas celulares duro para adaptarse iPS, - Recoger la suspensión de células de cada placa de cultivo en distintos tubos de 15 ml cónicos. Enjuague cada recipiente de cultivo con una cantidad apropiada de medio completo SR golpe de gracia, y añadir el D-PBS enjuague medio en los tubos de 15 ml cónicos que contengan la suspensión celular. Tenga cuidado de no romper los cúmulos de células en células individuales
- Centrífuga de 15 ml en tubos cónicos de 200 xg durante 5 minutos para que sedimenten las CMPi.
- Aspirar el sobrenadante del precipitado de IPSC. Resuspender el precipitado en una cantidad adecuada de KSR-FF medio de acuerdo con la relación de división (tabla 1). No romper los grumos de células de un tamaño más pequeño, porque las matas más pequeñas no se adhieren bien a la superficie.
Nota: Se recomienda una relación de división de 1:2 para los 3 primeros pasos después de la CMPi han pasajes directamente desde el medio de cultivo iPSC MEF para KSR-FF medio. Normalmente, una relación de separación 01:03-01:05 es apropiado, pero los pases en 01:02 garantiza la mayor densidad de células necesarias para la adaptación de una cultura de enlace de forma gratuita. - Antes de la chapa en los platos CMPi Geltrex recubierto, aspirar residual solución Geltrex del plato pre-revestidos, y se añade lentamente una cantidad apropiada de la suspensión celular a cada plato de cultivo. Nota: No enjuague los platos antes de la galvanoplastia.
- Mover el plato de la cultura de ida y vuelta y de lado a lado varias veces para dispersar las células en la superficie del plato. Con cuidado, coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera húmeda de CO 4 al 6% 2 en el aire. Sustituya el medio pasó con KSR-FF todos los días.
Pases células iPS humanas con KSR-FF
- Tenga en cuenta las CMPi humanos crecen en completa KSR-FF bajo el microscopio para confirmar que las células son del 70-80% confluentes y listo para ser subcultivaron. Refiérase a la Figura 1.
Nota: Si las colonias es muy densa o demasiado grande, mayor diferenciación se produce. - Cortar y eliminar cualquier colonias iPSC diferenciadas antes de pases de la cultura.
- Pre-caliente el volumen necesario de Dispasa en un baño de agua a 37 ° C. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Pre-equilibrar el volumen requerido de KSR-FF en un baño de agua 37 ° C for15 min. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Aspirar el medio transcurrido desde el recipiente de cultivo con una pipeta, y aclarar las células dos veces con D-PBS.
- Suavemente agregar precalentado Dispasa solución al recipiente de cultivo (por ejemplo, 1 ml de solución Dispasa por placa de cultivo de 60 mm). Agitar el recipiente de cultivo para cubrir la superficie entera de la célula.
- Incubar el recipiente de cultivo a 37 ° C durante 3 minutos.
- Retire el vaso de la incubadora, se aspira la solución Dispasa, y lavar suavemente las células con D-PBS.
- Raspe suavemente las células de la superficie de la placa de cultivo con un rascador de células, y la transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
- Enjuague la placa de cultivo en dos ocasiones con KSR-FF, con suavidad "pulverización de" cualquier célula que no se han desprendido. La piscina del enjuague medio con las células en el tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 200 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células.
- Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular y lo descarta.
- Agitar suavemente el tubo para desalojar completamente el pellet de células de la parte inferior del tubo.
- Resuspenda suavemente las células pre-equilibrio KSR-FF con una pipeta serológica de 5 ml. No triturar. Nota: es fundamental en el paso para volver a suspender suavemente las células sin usar la fuerza para evitar daños.
- Transferencia de las células a un nuevo máximo de 60 mm Geltrex recubiertos plato en la relación de división que desee y mover la placa de cultivo de ida y vuelta y de lado a lado varias veces para dispersar las células a través de su superficie.
- Coloque el plato de cultivo en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera húmeda de4 a 6% de CO 2 en el aire.
- Al día siguiente, reemplazar el cuidado medio gastado con KSR-FF para eliminar los restos celulares. Vuelva a colocar el medio gastado todos los días a partir de entonces. Observar las células iPS diario y el paso cuando sea necesario (aproximadamente cada 4-5 días). Pases se recomienda cuando las células alcanzan el 70-80% de confluencia. Para la criopreservación de células iPS y deshielo, se refieren a nuestro protocolo titulado "criopreservación y recuperación de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Medio".
Resultados esperados
Figura 1. La imagen de contraste de fase muestra CMPi cultivadas en placas de cultivo Geltrex recubiertos con alimentador de Libre completa golpe de gracia en suero de sustitución medio. La exposición CMPi morfología similar a hESCs, que se caracteriza por núcleos grandes y escaso citoplasma. (40 aumentos)
| Componente | 35 mm del plato | Plato de 60mm | Plato de 100 mm |
| Completa golpe de gracia SR medio | 2 mL | 4 ml | 10 ml |
| Geltrex Solución | 1 mL | 1,5 ml | 4.5 mL |
| Dispasa | 0,5 ml | 1 mL | 3.4 mL |
| D-PBS para enjuagar | 2 mL | 4 ml | 10 ml |
Tabla 1. Los volúmenes recomendados
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | Cat. no. 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products | |
| GlutaMAX-I | Cat. No. 35050-061 | ||
| KnockOut Serum Replacement | KnockOut SR, Cat. no. 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | bFGF, Cat. no. PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | Cat. no. 21985-023 | ||
| Dispase | Cat. no. 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods. | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | Cat. no. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | Cat. no. 14190-144 | ||
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60mm Tissue Culture treated dishes |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
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