Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Summary

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Abstract

De ontdekking in 2006 dat de mens en muis fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd om iPS cellen ^1-3 met kwaliteiten opvallend vergelijkbaar met embryonale stamcellen te genereren heeft een belangrijke nieuwe bron van pluripotente cellen voor drug discovery, celtherapie en fundamenteel onderzoek.

GIBCO media en reagentia zijn in de voorhoede van de pluripotente stamcel-onderzoek voor jaren. Knockout DMEM aangevuld met Knockout Serum Vervanging is in de media van de keuze voor embryonale stamcellen de groei en nu iPS celcultuur ^3-9. Deze gouden standaard media systeem kan nu worden gebruikt voor feeder-vrije cultuur met de toevoeging van Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Traditionele menselijke ES en iPS celcultuurmethoden vereisen het gebruik van muis of mens fibroblast feeder lagen, of feeder-geconditioneerd medium. Deze cultuur methoden zijn arbeidsintensief, moeilijk op schaal en het is moeilijk te onderhouden HIPS cellen ongedifferentieerd te wijten aan de undefined voorwaarden. Invitrogen heeft ontwikkeld Knockout SR Growth Factor Cocktail, zodat u gemakkelijk de overgang je heupen celculturen aan feeder-vrij met behoud van uw gebruik van Knockout SR.

Protocol

Opmerking: Om steriele cultuur voorwaarden te handhaven, zijn alle procedures in dit protocol uitgevoerd met steriele laboratorium-praktijken en uitgevoerd onder een laminaire stroming kap.

Voorafgaand aan de start, zorg ervoor dat elk medium is evenwicht gebracht tot 37 ° C en adequaat vergast.

Voorbereiden Geltrex-coated Cultuur Gerechten

Let op: zie bijlage voor het gebruik van gecoate CELLstart kweekschalen

1. Dooi een tube van Geltrex (1 ml) langzaam bij 2-8 ° C en verdund 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Meng de oplossing.
   
   Opmerking: Sommige iPS cellijnen kan een andere Geltrex verwatering voor een optimale groei nodig hebben. Zie bijlage voor alternatieve verdunningen.
2. Het gehele oppervlak van elke cultuur schotel met de Geltrex oplossing (1 ml voor een 35-mm schaal, 1,5 ml voor een 60-mm schotel).
3. Seal ieder gerecht met Parafilm om het drogen te voorkomen en incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   
   NB: Op dit punt kunt u de Geltrex gecoate cultuur gerechten bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Seal ieder gerecht met Parafilm om de Geltrex niet uitdrogen.
4. Voorafgaand aan het gebruiken, de overdracht van de Geltrex-gecoate gerechten tot een laminaire stroming kap en laat ze op kamertemperatuur (ongeveer 1 uur).

Voorbereiden Compleet KnockOut SR Feeder-vrij medium

1. Voor te bereiden 1 ml van 10 ug / ml Basic FGF-oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
   
   

   Basic FGF	10 pg
   D-PBS	990 uL
   10% BSA	10 pi

   
   
   Opmerking: BSA kan worden vervangen door HSA of Knockout SR bij dezelfde concentratie.
2. Ter voorbereiding op 50 ml van 2 mg / ml Dispase oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Filter steriliseren de oplossing en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
   
   

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. Aan 100 ml van complete KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) medium aseptisch combineren van de componenten die in de tabel hieronder voor te bereiden.
   
   

   Bestanddeel	Concentratie voorraad	Uiteindelijke concentratie	Volume
   Knockout DMEM/F12 (Cat. Nr. +12.660-012)	-	1X	76,8 mL
   Glutamax-I (Cat. nr. 35050-061)	200 mM	2 mM	1 mL
   SR KnockOut (Cat. Nr. 10,828-028)	-	20%	20 ml
   KnockOut SR-GFC (Cat. Nr. A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (Cat. Nr. PHG0024)	10 ug / mL	20 ng / mL	200 pi

   U mag de KSR-FF medium bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week.
4. Vlak voor de complete medium pre-equilibreren de temperatuur en gassen, aseptische wijze de vereiste hoeveelheid 2 mercaptoethanol (55 mM voorraad concentratie) voor een 0,1 mM eindconcentratie. Bijvoorbeeld, om 100 ml KSR-FF medium voor te bereiden 182 pi van 55 mM 2-mercapto-ethanol (1:550 verdunning) alternatief toe te voegen, kan de 2-mercapto-ethanol worden toegevoegd aan het 1X voltooide medium en bewaard bij 2-8 ° C voor tot een week.

Aanpassing iPSCs naar KSR-FF Medium

1. Voorafgaand aan de start, pre-evenwicht je Geltrex gecoat gerechten op kamertemperatuur in de motorkap.
2. Cultuur van de iPSCs op MEF feeder-cellen tot ze 70-80% confluent. Raadpleeg de GIBCO muis embryonale Fibroblast handboek voor MEF-gebaseerde cultuur protocollen. Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes.
3. Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes.
4. Zuig het medium van de cultuur gerechten, en voeg een juiste hoeveelheid Dispase oplossing. Incubeer de gerechten bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten.
5. Zuig het Dispase oplossing van elke cultuur schip en afwassen van de MEF feeder cellen voorzichtig met D-PBS (2 tot 3 keer).
6. Voeg een passend bedrag van complete KnockOut SR medium om elke cultuur schip. Gebruik een cel krabber of een 5 mL pipet om voorzichtig de cellen schrapen van het oppervlak van de cultuur schip.
   
   Let op: zie bijlage voor alternatieve aanpassing protocollen voor moeilijk te iPS passen cellijnen,
7. Verzamel de celsuspensie van elke cultuur schotel in aparte 15 ml conische buizen. Spoel elke cultuur schip met een geschikte hoeveelheid van complete KnockOut SR medium, en voeg de D-PBS spoelen medium in de 15 ml conische buizen met daarin de celsuspensie. Wees voorzichtig niet naar de cel klonten te breken in enkele cellen
8. Centrifugeer de 15 ml conische buizen op 200 xg gedurende 5 minuten om de pellet iPSCs.
9. Zuig het supernatans van de IPSC pellet. Resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid van de KSR-FF medium volgens de split ratio (tabel 1). Breken niet de cel klompen naar een kleiner formaat, omdat de kleinere klonters niet goed hechten aan het oppervlak.
   
   Opmerking: We raden een splitsing van 1:2 voor de eerste 3 passages na de iPSCs zijn direct passage uit de IPSC MEF Cultuur Middelgrote tot KSR-FF medium. Normaal gesproken, een splitsingsverhouding 1u03-01u05 geschikt is, maar passage op 01:02 zorgt ervoor dat de hogere dichtheid van de cellen die nodig zijn bij de aanpassing in een feeder-vrije cultuur.
10. Voorafgaand aan de beplating van de iPSCs op Geltrex gecoat gerechten, zuigen resterende Geltrex oplossing uit de pre-gecoate schaal, en langzaam een ​​gepaste hoeveelheid celsuspensie toe te voegen aan elke cultuur gerecht. Let op: niet voor spoelen gerechten plating.
11. Verplaats de cultuur schotel heen en weer en links naar rechts een paar keer naar de cellen over het oppervlak van de schotel te verspreiden. Plaats voorzichtig de cultuur schotel in een 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van 4 tot 6% CO ₂ in de lucht. Vervang de gebruikte medium met KSR-FF elke dag.

Passage menselijke iPS cellen met behulp van KSR-FF

13. Let op de menselijke iPSCs groeien in volledige KSR-FF onder de microscoop te bevestigen dat de cellen 70-80% confluent en klaar om te worden subcultuur. Zie figuur 1.
    
    Opmerking: Als kolonies worden te dicht of te groot is, meer differentiatie optreedt.
14. Knip en voorafgaande verwijder gedifferentieerde IPSC kolonies op passage van de cultuur.
15. Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes.
16. Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes.
17. Zuig het bestede medium van de cultuur schip met behulp van een pipet, en tweemaal spoelen van de cellen met D-PBS.
18. Voorzichtig toe te voegen voorverwarmde Dispase oplossing voor de cultuur vat (bijv. 1 ml Dispase oplossing per 60-mm cultuur schotel). Swirl de cultuur schip voor het coaten van de hele cel oppervlak.
19. Incubeer de cultuur vat bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
20. Verwijder het schip uit de incubator, zuigen de Dispase oplossing, en voorzichtig wassen van de cellen met D-PBS.
21. Zachtjes schrapen van de cellen van het oppervlak van de cultuur schotel met behulp van een cel schraper, en breng de cellen om een ​​steriele 15 ml centrifugebuis.
22. Twee keer Spoel de cultuur schotel met KSR-FF, zacht "spuiten uit" alle cellen die niet los. Het zwembad van het spoelen medium met de cellen in de 15 ml buis.
23. Centrifugeer de buis op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om pellet de cellen.
24. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet en gooi hem weg.
25. Tik zachtjes tegen de buis om volledig de cel pellet verjagen uit de tube bodem.
26. Voorzichtig resuspendeer de cellen in de pre-evenwicht gebracht KSR-FF met behulp van een serologische pipet 5 ml. Niet vermaal. Let op: het is van cruciaal belang bij de stap om voorzichtig de cellen resuspenderen zonder geweld te gebruiken om schade te voorkomen.
27. Overdracht van de cellen om een ​​frisse 60-mm Geltrex-gecoate schaal op de gewenste split ratio en beweeg de cultuur schotel heen en weer en links naar rechts een paar keer naar de cellen over het oppervlak verspreiden.
28. Zet de schotel in een cultuur van 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van4 tot 6% CO ₂ in de lucht.
29. De volgende dag, zachtjes vervangt de gebruikte medium met KSR-FF naar cel vuil te verwijderen. Daarna vervangen door de gebruikte medium alledaagse. Let op de iPS cellen dagelijks en passage als dat nodig is (ongeveer om de 4-5 dagen). Passage wordt aanbevolen wanneer de cellen 70-80% confluentie bereiken. Voor iPS cellen cryopreservatie en ontdooien, zie ons protocol met de titel "Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium".

Verwachte resultaten

Figuur 1. De fase contrast afbeelding hieronder toont iPSCs geteeld op Geltrex gecoate cultuur gerechten met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium. De iPSCs vertonen morfologie lijken op hESC 's, die wordt gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma. (40x vergroting)

Bestanddeel	35mm Dish	60mm Dish	100mm Dish
Compleet KnockOut SR medium	2 mL	4 mL	10 ml
Geltrex Solution	1 mL	1,5 ml	4-5 ml
Dispase	0,5 ml	1 mL	3-4 ml
D-PBS voor het spoelen	2 mL	4 mL	10 ml

Tabel 1. Aanbevolen Volumes

Klik hier om de bijlage te zien .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes