Summary
Le protocole suivant fournit des instructions pour l'adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l'entretien continu sont également fournis.
Abstract
La découverte en 2006 que les fibroblastes humains et de souris pouvaient être reprogrammées pour produire des cellules iPS 1-3 avec des qualités remarquablement similaires aux cellules souches embryonnaires a créé une nouvelle source précieuse de cellules pluripotentes pour la découverte de médicaments, la thérapie cellulaire, et la recherche fondamentale.
Les médias et les réactifs GIBCO ont été à la pointe de la recherche de cellules souches pluripotentes pendant des années. Knockout DMEM supplémenté avec remplacement Knockout sérum est le média de choix pour la croissance des cellules souches embryonnaires et maintenant la culture de cellules iPS 3-9. Cet or média standard du système peut maintenant être utilisé pour le chargeur sans la culture avec l'ajout de SR Knockout facteur de croissance cocktail.
Traditionnelle ES humaines et des méthodes de culture de cellules iPS nécessite l'utilisation de la souris ou humains couches nourricières de fibroblastes, ou le chargeur milieu conditionné. Ces méthodes de culture sont une main-d'œuvre, dur à l'échelle et il est difficile de maintenir les cellules indifférenciées hanches à cause des conditions indéfini. Invitrogen a développé SR Knockout facteur de croissance cocktail pour vous permettre de passer facilement vos cultures hanches cellule d'alimentation sans tout en conservant votre utilisation du SR Knockout.
Protocol
Remarque: Pour maintenir des conditions de culture stérile, toutes les procédures dans ce protocole sont réalisées en utilisant des pratiques de laboratoire stérile et réalisée sous hotte à flux laminaire.
Avant de commencer, s'assurer que tout média est équilibré à 37 ° C et de manière appropriée gazés.
Préparation des boîtes de culture Geltrex enduits
Note: voir l'annexe pour l'utilisation de plats CELLstart culture revêtues
- Dégeler un tube de Geltrex (1 ml) lentement à 2-8 ° C et diluer 1:100 c'est dans 99 ml de Knockout D-MEM/F-12. Mélanger délicatement la solution.
Remarque: Certaines des lignées de cellules iPS peuvent nécessiter une dilution différente Geltrex pour une croissance optimale. Voir l'annexe pour des dilutions alternatives. - Couvrir toute la surface de chaque boîte de culture avec la solution Geltrex (1 ml pour un plat de 35 mm, 1,5 ml pour un plat de 60 mm).
- Sceau chaque plat avec du Parafilm pour éviter le dessèchement et incuber les plats pendant 1 heure à 37 ° C.
Remarque: À ce stade, vous pouvez stocker les boîtes de culture Geltrex enduits à 4 ° C jusqu'à un mois. Sceau chaque plat avec du Parafilm pour empêcher la Geltrex de se dessécher. - Avant d'utiliser, de transférer les plats Geltrex enduits d'une hotte à flux laminaire et de leur permettre de s'équilibrer à température ambiante (environ 1 heure).
Préparation complète d'alimentation sans SR KnockOut Medium
- Pour préparer 1 mL de 10 ug / ml solution FGF basique, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu'à 6 mois.
FGF basique 10 ug D-PBS 990 uL 10% de BSA 10 uL
Remarque: BSA peut être substitué avec HSA ou SR Knockout à la même concentration. - Pour préparer 50 ml de solution 2 Dispase mg / mL, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Filtre stériliser la solution et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
Dispase 100 mg D-PBS 50 ml - Pour préparer 100 ml de SR KnockOut complète Feeder-Free (KSR-FF) moyennes aseptiquement combiner les composants répertoriés dans le tableau ci-dessous.
Vous pouvez ranger le support KSR-FF à 2-8 ° C jusqu'à une semaine.Composante Concentration Stock Concentration finale Volume Knockout DMEM/F12 (Cat. no. 12660-012) - 1X 76,8 ml Glutamax-I (cat. n ° 35050-061) 200 mM 2 mM 1 ml KnockOut SR (Cat. no. 10828-028) - 20% 20 ml KnockOut SR-GFC (Cat. no. A10580-01) 50X 1X 2 ml bFGF (Cat. n. PHG0024) 10 ug / ml 20 ng / mL 200 uL - Juste avant la pré-équilibration du milieu complet à la température et de gaz, ajouter aseptiquement le volume requis de 2 mercaptoéthanol (55 mM de concentration des stocks) pour une concentration de 0,1 mM final. Par exemple, pour préparer 100 ml de KSR-FF moyennes ajoutez 182 uL de 55 mM de 2-mercaptoéthanol (1:550 dilution) Alternativement, le 2-mercaptoéthanol peuvent être ajoutés au milieu de 1X terminé et stocké à 2-8 ° C pour jusqu'à une semaine.
S'adapter aux iPSCs KSR-FF Medium
- Avant de commencer, pré-équilibrer votre vaisselle Geltrex revêtement à la température ambiante dans la hotte.
- Culture du iPSCs sur des cellules nourricières MEF jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 70-80%. S'il vous plaît se référer au manuel de fibroblastes de souris embryonnaires GIBCO pour les protocoles de culture à base MEF. Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d'eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis.
- Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l'eau. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis.
- Aspirer le support des boîtes de culture, et d'ajouter une quantité appropriée de solution Dispase. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 3-5 minutes.
- Aspirer la solution Dispase de chaque navire de la culture et de laver les cellules nourricières MEF doucement avec du D-PBS (2 à 3 fois).
- Ajouter une quantité appropriée de milieu KnockOut SR complets pour chaque navire de la culture. Utilisez un grattoir cellulaire ou une pipette de 5 ml à gratter délicatement les cellules de la surface du récipient de culture.
Note: voir l'annexe pour l'adaptation des protocoles alternatifs pour les lignes dures cellule de s'adapter iPS, - Recueillir la suspension de cellules de chaque boîte de culture en tubes séparés 15 ml conique. Rincer chaque récipient de culture avec une quantité appropriée de milieu KnockOut SR complets, et ajouter le D-PBS rincez moyenne dans les 15 ml tubes coniques contenant la suspension cellulaire. Soyez prudent de ne pas briser les mottes de cellules dans des cellules individuelles
- Centrifuger les tubes coniques 15 ml à 200 xg pendant 5 minutes pour culotter les iPSCs.
- Aspirer le surnageant du culot IPSC. Reprendre le culot dans une quantité appropriée de KSR-FF moyennes selon le rapport de split (tableau 1). Ne pas casser les mottes de cellules d'une taille plus petite, parce que les amas plus petits de ne pas attacher ainsi à la surface.
Remarque: Nous recommandons un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages après la iPSCs ont été repiquées directement du milieu iPSC Culture MEF à KSR-FF moyenne. Normalement, un rapport de split 1:03-1:05 est approprié, mais au repiquage 01h02 assure la plus grande densité de cellules nécessaires lors de l'adaptation à une culture nourricier libre. - Avant de plaquer les iPSCs sur les plats Geltrex revêtement, aspirer résiduelle solution Geltrex de l'antenne de pré-enduit, et ajoutez lentement une quantité appropriée de suspension cellulaire à chaque boîte de culture. Remarque: ne pas rincer la vaisselle avant le placage.
- Déplacer la boîte de culture avant en arrière et côté à l'autre à plusieurs reprises pour disperser les cellules sur la surface du plat. Placez délicatement la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée de 4 à 6% de CO 2 dans l'air. Remplacez le support passé avec KSR-FF tous les jours.
Le repiquage de cellules iPS humaines utilisant KSR-FF
- Respecter les iPSCs humaine de plus en plus complète KSR-FF sous le microscope pour confirmer que les cellules sont confluentes à 70-80% et prêt à être repiquées. Se reporter à la figure 1.
Remarque: Si les colonies deviennent trop dense ou trop grande, une différenciation accrue survient. - Découper et retirer toutes les colonies différenciées iPSC avant repiquage de la culture.
- Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d'eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis.
- Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l'eau. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis.
- Aspirer le milieu épuisé du récipient de culture à l'aide d'une pipette, et rincer les cellules deux fois avec du D-PBS.
- Ajouter délicatement solution de dispase préchauffée à la cuve de culture (par exemple, 1 ml de solution de dispase par boîte de culture de 60 mm). Agiter le récipient de culture pour enrober la surface des cellules entières.
- Incuber le récipient de culture à 37 ° C pendant 3 minutes.
- Retirez le récipient de l'incubateur, aspirer la solution Dispase, et laver délicatement les cellules avec du D-PBS.
- Gratter délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture cellulaire à l'aide d'un grattoir, et le transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml stérile.
- Rincer la boîte de culture à deux reprises avec KSR-FF, doucement "pulvériser off" toutes les cellules qui n'ont pas détaché. Piscine de rinçage moyenne avec des cellules dans le tube de 15ml.
- Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour un culot cellulaire.
- Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire et le jeter.
- Tapotez doucement le tube pour bien déloger le culot cellulaire du fond du tube.
- Doucement remettre les cellules en pré-équilibrée KSR-FF aide d'une pipette 5mL sérologique. Ne pas triturer. Remarque: il est essentiel à l'étape pour remettre les cellules en douceur, sans utiliser la force pour éviter tout dommage.
- Transférer les cellules d'une nouvelle de 60 mm Geltrex revêtement plat à rapport de division désiré et déplacer la boîte de culture avant en arrière et côté à l'autre à plusieurs reprises pour disperser les cellules à travers sa surface.
- Placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée de4 à 6% de CO 2 dans l'air.
- Le lendemain, doucement remplacer le milieu passé avec KSR-FF pour éliminer les débris cellulaires. Remplacez le support passé tous les jours par la suite. Observez les cellules iPS quotidienne et le passage au besoin (environ tous les 4-5 jours). Le repiquage est recommandé lorsque les cellules atteignent 70-80% de confluence. Pour la cryoconservation de cellules iPS et de dégel, reportez-vous à notre protocole intitulé «cryoconservation et récupération des cellules iPS humaines à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium".
Résultats attendus
Figure 1. L'image en contraste de phase ci-dessous montre iPSCs cultivés sur des boîtes de culture Geltrex revêtement à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyenne. Les CISP présentent une morphologie similaire aux CSEh, caractérisé par de gros noyaux et cytoplasme. (Grossissement 40x)
| Composante | Plat 35mm | Plat 60mm | Plat 100mm |
| Remplissez KnockOut SR moyennes | 2 ml | 4 ml | 10 ml |
| Solution Geltrex | 1 ml | 1,5 ml | 4-5 ml |
| Dispase | 0,5 ml | 1 ml | 3-4 ml |
| D-PBS pour le rinçage | 2 ml | 4 ml | 10 ml |
Tableau 1. Volumes recommandés
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | Cat. no. 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products | |
| GlutaMAX-I | Cat. No. 35050-061 | ||
| KnockOut Serum Replacement | KnockOut SR, Cat. no. 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | bFGF, Cat. no. PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | Cat. no. 21985-023 | ||
| Dispase | Cat. no. 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods. | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | Cat. no. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | Cat. no. 14190-144 | ||
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60mm Tissue Culture treated dishes |
References
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