Summary
Следующий протокол предусматривает обучение для адаптации человека индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) Клетки для фидерных без культуры с помощью полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды (КСР-FF). Как только адаптированные, инструкции для постоянного обслуживания также обеспечены.
Abstract
Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках 1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.
GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур 3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.
Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перенести ваши бедра культур ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.
Protocol
Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе.
Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах.
Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры
Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры
- Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно.
Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения. - Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо).
- Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания. - Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа).
Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего
- Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев.
Основные FGF 10 мкг D-PBS 990 мкл 10% BSA 10 мкл
Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации. - Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель.
Dispase 100 мг D-PBS 50 мл - Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (KSR-FF) среду асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже.
Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели.Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) - 1X 76,8 мл GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) - 20% 20 мл KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл bFGF (кат. нет. PHG0024) 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл - Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С в течение до одной недели.
Адаптация к iPSCs KSR-FF среднего
- Перед началом, предварительно уравновешиваются ваш Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры в капюшон.
- Культура iPSCs на клетки MEF подачи, пока они не 70-80% вырожденная. Пожалуйста, обратитесь к GIBCO мышиных эмбриональных фибробластов пособие для MEF протоколы на основе культуры. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
- Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
- Аспирируйте среды от культуры блюд, а также добавить соответствующее количество Dispase решение. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 3-5 минут.
- Аспирируйте Dispase решения от каждой культуры судна и смыть клетки MEF подачи осторожно D-PBS (от 2 до 3 раза).
- Добавить соответствующей суммы полной среды SR KnockOut к каждой культуры судна. Используйте скребок ячейки или 5 мл пипетки, чтобы мягко очистить клетки с поверхности сосуда для культивирования.
Примечание: см. Приложение альтернативные протоколы адаптации трудно адаптироваться плюрипотентных клеточных линий, - Сбор клеточной суспензии из каждой культуры блюдо на отдельные 15 мл конические пробирки. Промыть каждую культуру сосуд с соответствующим количеством полной среде SR нокаутом, и добавить D-PBS промыть среды в 15 мл конические пробирки, содержащие суспензии клеток. Будьте осторожны, чтобы не сломать ячейки сгустки в одиночных камерах
- Центрифуга 15 мл конические пробирки при 200 мкг в течение 5 минут, чтобы гранулы iPSCs.
- Аспирируйте супернатант из IPSC гранул. Ресуспендируют пеллет в соответствующее количество KSR-FF среды согласно коэффициенту распределения (табл. 1). Не разбивайте ячейки сгустки до меньшего размера, потому что меньшие сгустки не придают скважины на поверхность.
Примечание: Мы рекомендуем разделить соотношении 1:2 в течение первых 3 места после iPSCs были пассировали непосредственно из культуральной среды IPSC MEF для KSR-FF среды. Как правило, раскол соотношение между 1:3 и 1:05 уместна, но пассажи в 1:02 обеспечивает более высокую плотность клеток, необходимых при адаптации в фидерных свободной культуры. - До покрытия iPSCs на Geltrex покрытием блюда, аспирации остаточного решение Geltrex из предварительно покрытых блюдо, и постепенно добавить соответствующее количество суспензии клеток в каждой культуре блюдо. Обратите внимание: не полоскать блюд до обшивки.
- Перемещение культуры блюдо вперед и назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки по всей поверхности блюда. Аккуратно культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Замените провел среде с KSR-FF с каждым днем.
Пассирования клеток человека плюрипотентных использованием KSR-FF
- Соблюдайте человека iPSCs растет в полной KSR-FF под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки 70-80% сливной и готова к пересеву. См. Рисунок 1.
Примечание: Если колонии становятся слишком плотная или слишком большим, увеличилась дифференциация происходит. - Вырежьте и удалите все дифференцированные IPSC колонии до пассажей культуры.
- Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
- Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется.
- Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS.
- Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки.
- Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут.
- Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS.
- Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку.
- Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки.
- Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток.
- Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его.
- Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки вниз.
- Аккуратно ресуспендирования клеток в предварительно уравновешенную KSR-FF использованием 5 мл серологические пипетки. Не растирают. Примечание: очень важно, на шаг, чтобы аккуратно ресуспендируют клетки без применения силы, чтобы избежать повреждений.
- Передача клетки свежих 60-мм Geltrex покрытием блюдо в нужном Коэффициент распределения и двигаться культуры блюдо вперед-назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки через ее поверхность.
- Место культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфереОт 4 до 6% СО 2 в воздухе.
- На следующий день, мягко заменить провел среде с KSR-FF, чтобы удалить ячейку мусора. Замените провел среда повседневной после этого. Соблюдайте плюрипотентных клетках ежедневно и прохождение их по мере необходимости (примерно раз в 4-5 дней). Пассирования рекомендуется, когда клетки достигают 70-80% слияния. Для КП криоконсервации клеток и оттаивания, обратитесь к нашему протокол под названием "Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена Medium".
Ожидаемые результаты
Рисунок 1. Изображение фазового контраста ниже показаны iPSCs выросли на Geltrex покрытием культуры блюда с использованием полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды. IPSCs выставку морфологии похож на ЭСК, характеризуется большими ядрами и скудной цитоплазмой. (40-кратном увеличении)
| Компонент | 35 блюд | Блюдо 60 мм | Блюдо 100 мм |
| Полное KnockOut SR среда | 2 мл | 4 мл | 10 мл |
| Решение Geltrex | 1 мл | 1,5 мл | 4-5 мл |
| Dispase | 0,5 мл | 1 мл | 3-4 мл |
| D-PBS для полоскания | 2 мл | 4 мл | 10 мл |
Таблица 1. Рекомендуемые объемы
Disclosures
Авторы этой статьи являются сотрудниками Life Technologies, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | Cat. no. 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products | |
| GlutaMAX-I | Cat. No. 35050-061 | ||
| KnockOut Serum Replacement | KnockOut SR, Cat. no. 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | bFGF, Cat. no. PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | Cat. no. 21985-023 | ||
| Dispase | Cat. no. 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods. | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | Cat. no. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | Cat. no. 14190-144 | ||
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60mm Tissue Culture treated dishes |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
- Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
- Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).
